克罗恩病患者外周血单个核细胞中miR-27a 的表达水平及意义

何 英 姜建春 李登云 黄 娟

克罗恩病（CD）是一种病因尚未明确的慢性炎性肠病，主要表现为发热、腹痛、腹泻、腹部包块及瘘管形成等，严重影响着患者的生活质量[1-2]。CD 患者的临床表现差异较大，部分患者在临床缓解后频繁复发，对于该类患者应及时救治，避免发生肠梗阻、腹腔脓肿等并发症[3]。近年来随着英夫利西单抗和阿达木单抗的临床应用，CD 的临床缓解率已大幅升高，但仍有部分患者发生严重的并发症，甚至需接受肠切除术治疗[4]。因此，及早了解CD 患者的预后情况，及时采取针对性的干预措施，具有重要意义。

miRNA 是一类不具备编码蛋白质功能的单链RNA[5]。随着基因诊疗技术的发展，多种miRNA 被证实参与了CD 的发病和进展过程[6-8]。研究显示，miR-27a 可通过调节Toll 样受体4（TLR4）/NF-κB 信号通路抑制成纤维样滑膜细胞的迁移和侵袭[9]。此外，miR-27a 还可通过调节TLR4/NF-κB 信号通路抑制IL-1β 诱导的关节软骨细胞炎性反应[10]。研究指出，TLR4/NF-κB 信号通路参与了CD 的发病及进展过程[11]。基于上述研究，推测miR-27a 可能通过调节TLR4/NF-κB 信号通路参与了CD 的病理、生理过程，其表达水平或可反映CD 患者的预后情况。本研究检测了CD 患者外周血单个核细胞中miR-27a的表达水平，并探究其与CD 患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016 年8 月至2017 年3 月在浙江衢化医院就诊的114 例CD 患者作为研究对象。参照《中国炎症性肠病组织病理诊断共识意见》[12]诊断CD。纳入标准：（1）年龄＜70 岁；（2）接受结直肠镜检查，确诊为CD；（3）中、重度活动期CD；（4）能够配合完成研究所需检查；（5）签署了知情同意书。排除标准：（1）合并恶性肿瘤；（2）近期接受过激素或免疫相关治疗；（3）急性胃肠炎；（4）凝血功能异常；（5）合并心、脑血管疾病；（6）在前3 个月的随访期间发生CD 相关并发症、肠黏膜异型增生或CD 相关死亡，以及接受肠切除术治疗者；（7）CD 家族史。114 例CD 患者中男性64 例，女性50 例；年龄26～62 岁，平均年龄为（42.38±7.61）岁；中度活动期78 例，重度活动期36 例。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 治疗方案

参照《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2012年·广州）》[13]治疗CD 患者。所有患者均给予常规治疗，包括纠正水、电解质紊乱，营养支持，保护肠黏膜及调节肠道菌群等。此外，根据患者的病情严重程度给予硫唑嘌呤（由上海信谊药厂有限公司生产，每日1.5～4.0 mg/kg）或英夫利西单抗（由Cilag AG 公司生产，每次5.0 mg/kg）治疗。

1.3 预后评估

采用复诊和电话随访的方式了解CD 患者的预后情况。于患者出院后1 个月开始随访，为期3 年，每个月随访1 次，末次随访时间为2020 年3 月5 日。将CD 相关并发症（如肠瘘、肠梗阻、复杂肛瘘、消化道大出血、肠穿孔及腹腔脓肿等）、接受肠切除术治疗、肠黏膜异型增生或CD 相关死亡定义为预后不良[14]。

1.4 外周血单个核细胞中miR-27a 水平检测

采用Ficoll 密度梯度离心法提取CD 患者外周血中的单个核细胞。分别于CD 患者治疗前、治疗2 周时和治疗6 周时抽取空腹肘部静脉血10 mL，室温下以800 r/min（离心半径为8 cm）离心15 min，取离心后下层沉淀物，将其置于10 mL Ficoll 分离液中，提取外周血中单个核细胞。采用实时荧光定量PCR 法检测外周血单个核细胞中miR-27a 的表达水平。在装有单个核细胞的试管中加入TRIzol 试剂，提取总RNA，使用紫外分光光度计检测总RNA 的纯度。取2 μg 总RNA 至反转录试剂盒中，反转录生成cDNA。使用PCR 仪进行扩增反应，反应条件为95 ℃预变性10 min，之后95 ℃变性15 s，60 ℃退火32 s，72 ℃延伸30 s，共计40 个循环。以β-actin 作为内参，采用2-ΔΔCt法表示miR-27a 的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 统计学方法

采用SPSS 24.0 软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，组内治疗前后比较采用配对样本t检验。治疗前、治疗2 周时、治疗6周时的外周血单个核细胞中miR-27a 水平的比较采用重复测量方差分析。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用ROC 曲线评估外周血单个核细胞中miR-27a 水平判断CD 预后的效能。采用多因素logistic 回归方法分析影响CD 预后的因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD 患者的预后情况

114 例CD 患者中有51 例（44.74%）预后不良，包括8 例（7.02%）肠瘘，9 例（7.89%）复杂性肛瘘，3 例（2.63%）消化道大出血，4 例（3.51%）腹腔脓肿，4 例（3.51%）肠梗阻，22 例（19.30%）接受肠切除术，1 例（0.88%）死亡。根据CD 患者的预后情况将其分为预后不良组（n＝51）和预后良好组（n＝63）。

2.2 两组外周血单个核细胞中miR-27a 水平比较

由表2 可知，在治疗2 周时和治疗6 周时，预后良好组的miR-27a 水平均高于预后不良组，差异均有统计学意义（P均＜0.001）；组内比较结果显示，两组治疗前、治疗2 周时和治疗6 周时的miR-27a 水平差异均具有统计学意义（P均＜0.001），两组的miR-27a 水平随治疗时间延长均呈升高趋势，且预后良好组的miR-27a 水平升高幅度大于预后不良组（P＜0.05）。

表2 两组miR-27a 的表达水平比较

2.3 miR-27a 判断CD 患者预后的效能

由表3 可知，治疗6 周时的外周血单个核细胞中miR-27a 水平判断CD 患者预后的ROC 曲线下面积（AUC）大于治疗前和治疗2 周时，差异均有统计学意义（Z＝5.893，P＜0.001；Z＝3.124，P＝0.002）。治疗2 周时的miR-27a 水平判断CD 患者预后的AUC 大于治疗前，差异有统计学意义（Z＝2.254，P＝0.024）。见图1。

表3 miR-27a 判断CD 患者预后的效能

图1 miR-27a 判断CD 预后的ROC 曲线

2.4 两组的基本资料比较

两组患者在性别、病变部位和吸烟史方面比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。预后不良组中确诊年龄（A3 型）、疾病行为（穿透型）、肛周病变患者的占比均高于预后良好组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见表4。

2.5 治疗6 周时的miR-27a 水平与CD 患者临床病理特征的关系

由表5 可知，CD 患者治疗6 周时的miR-27a水平与确诊年龄、性别、病变部位、疾病行为、吸烟史、肛周病变均无关（P均＞0.05）。

2.6 影响CD 患者预后的危险因素分析

将CD 患者的预后情况作为因变量，将单因素分析中可能与CD 患者预后有关的项目[确诊年龄（A3 型）、疾病行为（穿透型）、肛周病变和治疗6 周时的miR-27a 水平]作为自变量，纳入多因素logistic 回归分析模型，结果显示疾病行为（穿透型）、肛周病变是CD 患者预后的独立危险因素（P＜0.05），治疗6 周时的miR-27a 是CD 患者预后的独立保护因素（P＜0.05）。见表6。

表4 两组的基本资料比较/例（%）

表5 不同临床病理特征的CD 患者治疗6 周时的miR-27a 水平比较

表6 影响CD 患者预后的多因素logistic 回归分析

3 讨论

TLR4/NF-κB 信号通路的激活可上调炎性细胞因子水平，从而加重CD 患者肠黏膜的炎性反应[15]。TLR4 对肠黏膜先天性免疫反应具有调节作用，可参与调节肠道微生态平衡[16]。研究表明，miR-27a可通过调节TLR4/NF-κB 信号通路，抑制脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠的炎性反应，加重脑缺血小鼠血脑屏障紧密连接损伤[17-18]。本文主要探究CD患者外周血单个核细胞中miR-27a 的水平与预后的关系。

本研究的随访结果显示，有44.74%的CD 患者预后不良，预后不良者的比例略高于郝晓炜等[6]的报道，其原因可能是本研究纳入的CD 患者为中、重度活动期。本研究通过动态监测预后良好组和预后不良组外周血单个核细胞中miR-27a 的水平，发现随治疗时间延长，两组miR-27a 水平均呈升高趋势；此外，与预后不良组比较，预后良好组治疗2 周时、治疗6 周时的miR-27a 水平均较高。上述结果提示治疗后CD 患者外周血单个核细胞中miR-27a 水平可能与预后有关。本研究进一步构建了治疗前、治疗2 周时、治疗6 周时的miR-27a 水平判断CD 预后的ROC 曲线，结果显示治疗6 周时的miR-27a 水平判断CD 预后的AUC、敏感度和特异度分别为0.893、94.12%和74.60%，该结果提示治疗6 周时的miR-27a 水平判断CD 预后的效能较高，但特异度较低，可辅助评估CD 预后。

黄超群等[19]的研究表明，CD 的疾病行为（狭窄型、穿透型）、肛周病变是其预后的独立危险因素。本研究采用多因素logistic 回归法分析了影响CD患者预后的相关因素，结果显示疾病行为（穿透型）、肛周病变是CD 预后的独立危险因素，与上述研究结果相符。此外，本研究结果还指出，治疗6 周时的miR-27a 水平是CD 预后的独立保护因素。

综上所述，CD 患者外周血单个核细胞中miR-27a 的表达水平较低，且其表达水平越低，提示患者发生预后不良的风险越高。治疗6 周时的外周血单个核细胞中miR-27a 的水平判断CD 的预后具有较高价值。今后本课题组将进一步开展基础研究，验证miR-27a 是否通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路降低炎性细胞因子水平，从而减轻CD 患者肠黏膜的炎性反应。