木质素降解真菌菌群LDFC 产酶条件优化

王敬红 ，李灵灵 ，申贵男 ，2，袁媛 ，2，曹迪 ，高亚梅 ，晏磊 ，2，王伟东 ，2

（1.黑龙江省寒区环境微生物与农业废弃物资源利用重点实验室/黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.粮食副产物加工与利用教育部工程中心）

我国是农业大国，每年产出近9 亿t 农作物秸秆，这些农业废弃物一般被用沼气发酵、堆肥、造纸等而实现其循环利用[1-4]。但在秸秆资源化过程中遇到了很多困难，主要原因之一便是木质素的存在，在高等植物细胞壁的维管组织中，木质素与半纤维素和纤维素的纤丝通过共价键与非共价键紧密缠绕相互嵌合，形成秸秆的主要成分木质纤维素[5]。木质素在外层的保护，严重阻碍了木质纤维素的高值化利用[6]。

处理农业废弃物中木质素的方式有很多，例如物理处理、化学处理、生物处理等[7-9]。其中，生物处理可以在较为温和的温度和压力下降解木质素，其低能量消耗和环境友好的特点使其成为研究热点[10-11]。在降解木质素的微生物中，真菌能力更强[12]。而在众多能够降解木质素的真菌中，腐生真菌被认为是唯一可以完全矿化木质素的真菌，白腐真菌作为腐生真菌的一种，一直是木质素降解研究的重点。真菌对木质素的降解主要依赖于其产生的木质素酶，白腐真菌能够产生漆酶（Laccase，Lac）和锰过氧化物酶（Manganese perxidases，Mnp），少数还能产生木质素过氧化物酶（Lignin peroxidases，Lip），是最有效的木质素降解微生物[13-14]。但单一菌株的产酶能力有限，研究者发现利用多种微生物共同作用，可以提升产酶能力[15]。Teddy 等[16]对 T.polyzona、A.niger、T.longibrachiatum、M.circinelloides 和 R.microsporus 四种真菌共培养后木质素降解酶产量以及相关物质的降解能力进行了研究，发现漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的产量都较多。李会宣等[17]研究了白腐真菌 P-6（Pleurotus ostreatus）和 P-9（Lentinus edodes）共培养对玉米秸秆的降解以及木质素酶酶活力影响，发现共培养的降解效果和酶活力显著高于任意一株纯培养菌株。

Lac 是一种存在于植物、真菌、细菌和昆虫体内的多铜酶，真菌产生的Lac 被认为是自然环境中木质素分解的重要一环，所有漆酶都使用分子氧作为电子受体，氧化多种芳香族化合物，包括木质素中常见的酚类部分、芳香胺、苯甲硫醇和羟基吲哚。Mnp最早于30 多年前就已在金黄色葡萄球菌中发现，它是几乎所有定植于木材的担子菌（包括白腐菌和各种定植于土壤的真菌）产生和分泌的最常见的木质素修饰过氧化物酶。Lip 最早在黄孢原毛平革菌中发现，随后在变色栓菌等著名白腐真菌中都有发现，已知LiP 会氧化不同的酚类芳香族化合物，各种非酚类木质素模型化合物与许多其他有机分子一起氧化[18-19]。

研究表明，真菌Lac 既具有聚合作用（黑色素合成和子实体形成），也具有解聚合作用（木质素降解），真菌漆酶的这种双功能可以归因于同一属和不同种内的多种亚型的存在，而通过调控培养条件，这些具有不同诱导模式和独特生化特性的亚型可以被表达或过度表达[20]。周玥等[21]通过调节基质成分，实现了Mnp 的大量表达；P.Nayana 等[22]通过优化培养条件及添加剂等，使Lip 酶活增加40 倍。可见，对微生物培养基成分等培养条件的优化，将有效提升木质素降解酶的活性。

实验室前期利用 BYL-3 （Trametes hirsuta）、BYL-7 （Trametes versicolor）[23]和 BYL-8（Trametes hirsuta）三株白腐真菌，构建了一个木质素降解真菌菌群LDFC，实验在前期基础上对木质素降解真菌菌群LDFC 进行了产酶条件的优化，主要从碳源种类、氮源种类、Cu2+浓度、Mn2+浓度和诱导剂种类五个方面进行，为木质素的降解提供更加优质的微生物资源。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

菌株BYL-3、BYL-7 和BYL-8 由黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院寒区环境微生物与农业废弃物资源化利用重点实验室提供，NCBI 登录号分别为 MT360648、MN947224 和 MT360649。

1.1.2 培养基

PDA 培养基（液体培养基不加琼脂）：去皮马铃薯 200.0 g，葡萄糖 20.0 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，琼脂 15.0 g，蒸馏水 1000 mL，pH 自然。

初始产酶培养基：KH2PO42.0 g、（NH）42SO42.0 g、MgSO·47H2O 0.3 g、水稻秸秆粉6.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.0。

1.1.3 主要试剂、仪器与设备

葡萄糖、酵母粉、蛋白胨：天津市祥瑞鑫化工科技有限公司；愈创木酚、碱性木质素：上海麦克林生化科技有限公司；苯胺蓝：天津市鲁鑫化工科技有限公司；木质素：BOSF 公司 M0010。

EX224 万位天平：美国 Ohaus 公司；S010 微型pH 计：日本 Horiba 公司；HPS-280 生化培养箱、HZQ-C 恒温振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；TU-1901 紫外分光光度计：中国北京普析通用仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌群LDFC 的活化

将实验室前期筛选的3 株真菌BYL-3、BYL-7和BYL-8 在PDA 培养基上30 ℃培养5 d，用打孔器取直径8 mm 的所筛真菌菌落3 块置于含有PDA 液体培养基的锥形瓶中，各单菌在30 ℃、120 r·min-1条件下培养3 d 后，采用平板计数法计算菌落数，当菌液浓度达到106~107CFU·mL-1时，孢子菌悬液配制完成。将三种真菌的孢子菌悬液接种量按照1∶1∶1 进行配比制备菌群LDFC 的孢子菌悬液取出。以下试验不作特殊说明，接种量的孢子菌悬液浓度均为106~107CFU·mL-1，接菌量为 3.0%（v·v-1）。

1.2.2 产酶条件优化

在初始产酶培养基中分别添加浓度为5.0 g·L-1的麦芽糖（maltose）、葡萄糖（D-glucose）、蔗糖（sucrose）、淀粉 （starch）、乳糖 （lactose）、木质素（lignin）以及浓度为0.15 mol·L-1的甘油（按克数折算成摩尔浓度）。将孢子菌悬液按3.0%（v·v-1）接种量接入已灭菌的装有产酶培养基的锥形瓶内，初始pH调节为 6.0，在 30 ℃、120 r·min-1的条件下培养，第 4天测定 Lac 酶活、第 6 天测定 Lip 和 Mnp 酶活。3 次重复，以原初始产酶培养基作为空白对照，确定最适碳源。同样的培养条件依次试验氮源（初始产酶培养基为基础去除硫酸铵 （Ammonium sulphate，AS），再分别添加浓度为2 g·L-1硝酸铵（Ammonium nitrate，AN）、酒石酸铵 （Ammonium tartrate，AT）、硝酸钠（Sodium nitrate，SN）、氯化铵 （Ammonium chloride，AC）、酵母粉（Yeast extract，YE）、尿素（Urea）、蛋白胨（Peptone））、金属离子浓度（以初始产酶培养基为基础，再分别添加 Cu2+（CuSO4·5H2O）浓度分别为0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol·L-1和Mn2（+MnSO4·H2O）浓度分别为 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1）、诱导剂（用灭菌冷却的蒸馏水分别将诱导剂愈创木酚（guaiacol）、ABTS、藜芦醇 （veratryl alcohol）、吐温-80（Tween-80）、苯胺蓝（aniline blue）调节最终浓度均为 0.5 mmol·L-1）对菌群 LDFC 产酶的影响。

1.2.3 酶活测定方法

将1.2.2 取得的粗酶液分别吸取1.5 mL 于2 mL无菌 EP 管，12 000 r·min-1离心 10 min 取上清，上清液即酶液，采用2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）法[24]测定 Lac 活性；参照池玉杰[25]的方法测定Lip 活性；参照Kuwahara[26]的方法测定Mnp 活性，设置3 个平行样品，取平均值。

2 结果与分析

2.1 碳源对真菌菌群LDFC 木质素降解酶活性的影响

由图 1 可知，Lac、Lip 和 Mnp 在氮源选择上呈现出的变化是同步的。以蔗糖、淀粉为碳源时，三种酶的酶活性皆比对照出现明显的下降，Lac 酶活达不到对照组的1/2；以木质素、乳糖、甘油为碳源时，Lac、Lip、Mnp 酶活相对于对照组存在小幅度提高，其中Lac 酶活提高较为明显；以葡萄糖为碳源时，Lac、Lip、Mnp 酶活均明显高于对照组，其中Mnp 酶活提高最为明显；当以麦芽糖为碳源时，Lac、Lip、Mnp 酶活均最高，Lac 酶活为 667.9 U·L-1，比对照组（279.4 U·L-1）提高 139.0%；Lip 酶活为 1 213.3 U·L-1，比对照组（981.6 U·L-1）提高 23.6%；Mnp 酶活为 1 967.3 U·L-1，比对照组（1 270.5 U·L-1）提高54.8%。

图1 碳源对LDFC 木质素降解酶活性的影响Fig.1 Effect of carbon sources on lignin degradation enzyme activity of LDFC

2.2 氮源对菌群LDFC 木质素降解酶活性的影响

由图2 可知，氮源种类对Lac、Lip 和Mnp 活性的影响趋势相似。当以硝酸钠为氮源时，Lac、Lip、Mnp 酶活均最高，Lac 酶活为 634.5U·L-1，比对照组（279.4 U·L-1）提高 127.1%；Lip 酶活为 1 421.3 U·L-1，比对照组（981.6 U·L-1） 提高 44.8%；Mnp 酶活为2 585.6 U·L-1，比对照组 （1 270.5 U·L-1） 提高103.5%。当氮源为酒石酸铵时，Lac、Lip、Mnp 酶活仅次于硝酸钠为氮源所对应的酶活。当以硝酸铵、尿素和蛋白胨为氮源时，Lac、Lip、Mnp 酶活相对于对照组均有所提高，但提高幅度不大。当以酵母粉和氯化铵为氮源时，Lac、Lip、Mnp 酶活相对于对照组均有所降低。

图2 氮源对LDFC 木质素降解酶活性的影响Fig.2 Effect of nitrogen sources on lignin degradation enzyme activity of LDFC

2.3 Cu2+和M2+浓度对真菌菌群LDFC 木质素降解酶活性的影响

菌群Lac 酶活相比Lip 和Mnp 酶活较低，由于Lac 是铜类氧化酶，适宜浓度的Cu2+能够最大程度提高Lac 的产生。由图3（A）可知，当添加Cu2+浓度为1.5 mmol·L-1时，Lac、Lip 和 Mnp 酶活均最高，Lac 酶活为 327.6 U·L-1，比未添加（160.4 U·L-1）提高 104.2%；Lip 酶活为 1 012.9 U·L-1，比未添加（831.6 U·L-1）提高 21.8%；Mnp 酶活为 1 310.4 U·L-1，比未添加（1 035.5 U·L-1）提高26.5%，当添加Cu2+浓度超过1.5 mmol·L-1，Lac、Lip 和 Mnp 酶活均呈现出明显下降趋势。

菌群木质素降解酶中由于Mn2+位于Mnp 蛋白的活性位点上，会影响酶基因的表达转录，进而影响Mnp 的生成。由图3（B）可知，当添加Mn2+浓度为0.2 mmol·L-1时，Lac、Lip 和 Mnp 酶活均最高，Lac 酶活为 273.9 U·L-1，比未添加（243.5 U·L-1）提高 12.5%；Lip 酶活为 1 011.4 U·L-1，比未添加（882.4 U·L-1）提高 14.6%；Mnp 酶活为 1 414.8 U·L-1，比未添加（670.6 U·L-1） 提高 111.0%，当 Mn2+浓度超过0.2 mmol·L-1时，3 种酶酶活均开始下降，但 Mnp 活性在Mn2+浓度为 0.2~0.6 mmol·L-1呈现显著下降，相较而言，Lac 和Lip 则呈现小幅度下降。

图3 Cu2+（A）和Mn2+（B）浓度对LDFC 木质素降解酶活性的影响Fig.3 Effect of Cu2+（A）and Mn2+（B）concentration on lignin degradation enzyme

2.4 诱导剂对真菌菌群LDFC 木质素降解酶活性的影响

研究发现，添加与木质素结构相似的酚类和芳香族化合物作为诱导剂可以提高木质素降解酶的活性。由图4 可知，添加适宜浓度的诱导剂均能提高木质素降解酶活性。当加入ABTS 和愈创木酚为诱导剂时，Lac 酶活提 升 较 大 ，Lac 酶 活 分别 为 609.2、476.1U·L-1，比对照组（279.4 U·L-1）分别提高118.0%、70.4%。当加入愈创木酚和白藜芦醇为诱导剂时，Lip酶活提升最大，Lip 酶活分别为 1 178.9、1 345.8 U·L-1，比对照组（981.6 U·L-1）分别提高 20.1%、37.1%。当加ABTS 为诱导剂时，Mnp 酶活提升最大，Mnp 酶活为1 814.3 U·L-1，比对照组（1 270.5 U·L-1）提高 42.8%；当加入愈创木酚、白藜芦醇和苯胺蓝为诱导剂时，对Mnp 酶活影响差别不大，Mnp 酶活分别为1 412.6、1 397.6、1 386.7 U·L-1，比对照组（1 270.5 U·L-1）分别提高11.2%、10.0%、9.1%。当以苯胺蓝和吐温-80 为诱导剂时，Lac、Lip、Mnp 酶活相对于对照组均呈现较小幅度提升。

图4 诱导剂对LDFC 木质素降解酶活性的影响Fig.4 Effect of inducer on lignin degradation enzyme activity of LDFC

2.5 最优条件酶活性

通过对影响菌群LDFC 木质素降解酶酶活因素的研究，初步确定了菌群LDFC 最佳产酶条件为：添加麦芽糖为复合碳源，硝酸钠为氮源，Cu2+浓度为1.5 mmol·L-1，Mn2+浓度为 0.2 mmol·L-1，ABTS 为诱导剂。由图5 可知，在上述条件下测定菌群Lac、Lip、Mnp 酶活，分别为 678.3、1 463.6、2 667.8 U·L-1，优化前 3 种酶酶活分别为 279.4、981.5、1 270.5 U·L-1。相比于优化前，Lac、Lip、Mnp 酶活分别提高 142.8%、49.0%、110.0%。

图5 优化前后木质素降解酶活性变化Fig.5 Changes of lignin degrading enzyme activity before and after optimization

3 讨论

木质素降解酶对农业废弃物具有重要的分解作用，通过对菌群培养条件的优化可以有效提升其木质素降解酶活性[27]，菌群中各个菌株在降解初期因生长较慢，往往需要补加一些碳源促进菌株的繁殖，通过增大微生物生物量来提高木质素降解酶活力，但同样的，有时也会存在碳源抑制的情况。Wang 等[28]发现，添加葡萄糖会抑制木聚糖酶的表达。而在实验中，当以蔗糖、淀粉可能出现了酶活性下降的情况，可能同样存在抑制。Mariane 等[29]研究发现，在真菌培养时添加麦芽糖或葡萄糖可有效提升其生长速度。在研究中，当以麦芽糖和葡萄糖为碳源时，三种酶的酶活都出现上调，这可能是其促进了真菌的生长。

菌群生长需要氮源，氮是合成氨基酸和核酸所必须的，适宜的氮源同样能有效提高酶活[30]。研究发现当以硝酸钠为氮源时，三种酶的酶活上调最为明显；Kannaiyan 等[31]在对白腐真菌Dichomitus squalens和Ceriporiopsis subvermispora 共培养，进行培养基优化时发现，以硝酸钠为氮源可以提升产酶，这与实验结果一致。菌群Lac 酶活相比Lip 和Mnp 酶活相对较低，由于Lac 是铜类氧化酶，适宜浓度的Cu2+能够促进Lac 的产生。孙荣等[32]通过研究添加Cu2+浓度对菌株产漆酶能力影响时发现，当Cu2+浓度为1.5 mmol·L-1时，产漆酶能力最强，这与实验研究结果一致。菌群木质素降解酶中由于Mn2+位于Mnp 蛋白的活性位点上，会影响酶基因的表达转录，进而影响Mnp 的生成，研究结果表明，当添加Mn2+浓度为0.2 mmol·L-1时，对菌群酶的表达最有利，继续增高离子浓度反而会抑制酶活性。

添加与木质素结构相似的酚类和芳香族化合物作为诱导剂可以提高木质素降解酶的活性。ABTS 是漆酶的重要底物，研究发现ABTS 可以促进木质素的降解[33]。在研究中，添加ABTS 作为诱导剂，三种酶酶活性得到显著提高。Lac、Lip 和Mnp 分别在造纸、化妆品、褐煤生物降解等方面具有较好的应用前景，菌群产酶活性的提升可提高菌群的可利用性。Vibha[34]将Trametes hirsuta 和Phanerochaete sp.混合培养，通过优化温度、pH、碳源等，优化后第7 d，共培养菌群Lac 酶活最大为250.0 U·L-1，比优化前提高220.5%。研究对菌群LDFC 产酶培养基中碳源、氮源、诱导剂等成分进行优化。优化后Lac 活性在第4 d 达到峰值为 678.3 U·L-1，Lip 和 Mnp 酶活均在第 6 d 达到峰值，分别为 1 463.6 U·L-1和 2 667.8 U·L-1，相比于优化前，Lac、Lip、Mnp 酶活分别提高 142.8%、49.0%、110.0%。与Vibha 的研究结果相比，虽其优化成果显著，但研究产酶活性始终较高；较两菌群优化后Lac活性，菌群LDFC 是其菌群2.7 倍，到达酶活峰值时间比其缩短3 d。

4 结论

研究探究了碳源、氮源、Cu2+浓度、Mn2+浓度以及诱导剂对菌群产木质素降解酶的影响，结果表明：当添加麦芽糖为复合碳源，硝酸钠（SN）为氮源，Cu2+浓度为 1.5 mmol·L-1，Mn2+浓度为 0.2 mmol·L-1，ABTS为诱导剂时，菌群 LDFC 的 Lac、Lip、Mnp 酶活，分别为 678.3、1 463.6、2 667.8 U·L-1，相比于优化前，三者酶活分别提高142.8%、49.0%、110.0%。研究表明，对菌群产酶条件的优化可以有效提高其酶产量，有利于菌群后续的规模化使用。