PCR-RFLP 鉴别驽巴贝斯虫和马泰勒虫方法的建立

胡阳，刘明月，王春仁，常巧呈

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

马梨形虫病（Equine piroplasmosis，EP）又称马焦虫病、马血孢子虫病，是一种寄生在红细胞或淋巴细胞内由蜱为传播媒介的血液寄生原虫病，可感染马、驴、骡等多种马属动物[1]。该病成世界性流行，在有大量马匹和有效传播蜱媒介的大多数国家广泛存在，主要疫源地包括热带、亚热带及一些温带地区[2]，我国东北、西北地区也常有报道[3]。本病具有极强的季节性，在我国，主要流行于每年的 3～5 月，2 月和 6～8月呈散发，病例一般随着当地媒介蜱的消长规律而变化[4]，梨形虫的全球分布与蜱虫的分布相似，在温带气候中，蜱中携带驽巴贝斯虫的情况比携带马泰勒虫的情况多。普遍来看，马泰勒虫病比驽巴贝斯虫病的患病率要高。

蜱虫有作为生物媒介传播该病的能力并且极为有效，在全球几乎所有的气候中都能找到有效的蜱虫媒介。现有的研究表明，有14 种蜱可以传播驽巴贝斯虫，分别为：4 种革蜱，4 种璃眼蜱，5 种扇头蜱和1 种花蜱；有15 种蜱可以传播马泰勒虫，分别是：7种革蜱，6 种璃眼蜱和1 种扇头蜱[1]。蜱的生活周期包括四个阶段，分别为卵、幼虫、若虫、成虫，根据这一特性，马属动物梨形虫的经蜱传播有三种方式：直接传播、期间传播和经卵传播[9]。尽管马泰勒虫的特定传播是因为不同的蜱种而异，但我们要认识到最重要的一点是，由于马泰勒虫是可以通过蜱的卵巢传播的，因此感染的阳性蜱虫可以作为群体内感染的感染源。但同一地区存在的蜱媒的传染能力和马匹的受感染能力是不同的，不一定会导致严重的疾病后果，必须还要考虑到许多因素，包括季节、天气、宿主专一性和有效蜱生活周期等细节问题。

感染该病后，可引起不同程度的溶血性贫血及相关系统疾病。急性感染初期会出现非特异性的标志，如高烧，昏睡，厌食，水肿和粘膜发绀。随着感染的加深，马会表现出溶血的症状，包括黄疸、粘膜苍白、心动过速、呼吸急促、无力和色素尿。其他系统的并发症也可能会对身体造成影响，包括腹泻、肺水肿、肺炎、色素性肾病、共济失调、肌肉疼痛、痉挛等。急性期的主要特征是爆发性的症状和猝死[5]。据报道，这种情况会在纯种马引入流行性地区的时候发生，或可发生在诊断为子宫内感染的新生小马驹上。这些马驹在刚出生就可能会有临床症状，或在新生2～3 d 发病，大多预后不良，导致死亡。临床症状一般为非特异性的，例如虚弱、哺乳量降低，但在成年动物感染中，也会出现相同的情况。慢性马泰勒虫病和驽巴贝斯虫病感染可能导致非特异性慢性炎症或感染，包括嗜睡、厌食、体重减轻、脱毛、轻度贫血，直肠检查会发现脾脏肿大。

感染后成功治愈的马属动物在临床上有着非常明显的带虫免疫特征，有研究表明，马匹在患马梨形虫病后，会带虫免疫长达7 年之久[6]，这些隐性带虫宿主不显示发病，但容易经过媒介蜱使马梨形虫阴性蜱感染该病，或直接通过蜱虫将带虫血传播给阴性马属动物。因此，带虫宿主的活动会直接影响本病的传播流行。值得注意的是，这两种寄生虫都可以进行有效的医源性传播，最典型的例子就发生在美国佛罗里达。一些赛马在参加未经批准的马赛前，会被注射一定剂量的兴奋剂，针头便可以传播阳性血液，导致了大量的马出现了明显的临床症状，同样，当使用了未经检测的或隐性携带者捐献的血也会发生感染。因此，在国际马匹交易的过程中规定，必须要进行马梨形虫病的检测[7]。

病原有两种，分别为驽巴贝斯虫和马泰勒虫，目前梨形虫的鉴别主要基于传统的形态学，是马梨形虫病最简捷的标准诊断技术[8]。方法需采集少量血液制作血涂片，染色后油镜观察红细胞中有无典型的虫体即可判定动物是否感染梨形虫，因而得到广泛应用。有研究表明，两种虫体的典型形态十分不同，驽巴贝斯虫大于红细胞半径，约为2～5 μm，呈成对的梨子形，马泰勒虫小于红细胞半径，约为2～3 μm，呈马耳他十字形[9]。然而，不同种株间或在不同发育时期的虫体形态相似，很难准确区分是驽巴贝斯虫感染、马泰勒虫感染亦或是二者混合感染。并且在通常情况下，被感染动物的染虫率达不到血涂片镜检的量，在染虫率过低的血液样本中，油镜下很难找到虫体，无法获得虫体的形态特征。除此之外，血涂片镜检的技术要求很高，染料浓度、血涂片的质量、染色时间等因素都可能会影响检测的结果，同时，检测人员要对梨形虫的背景知识有较多的了解，对在该病的疫情进行调查时费时费力。综上，对于该病病原的鉴别，还需要依托其他的技术方法。

随着分子生物学的发展，PCR 技术在病原鉴定中占有重要的地位，它相比于传统的形态学方法来说具有较高的敏感性，也广泛地应用于各种疾病的检测中[10]。目前已建立的检测马梨形虫PCR 方法较多，不同的方法引物可能不同，其目的基因分别有p82，rap-1，ema-1，ema-2，Bc48，Bc134 和 18S rRNA等。PCR 方法可检测多种来源的DNA 样品，如动物血液、动物骨髓、蜱等。其中，18S rRNA 基因被广泛的应用于马梨形虫的检测与分类研究中，PCR 技术在鉴定目标病原体方面也有着独特的优势，但想要鉴别感染马梨形虫的种类，仍需要通过特异性引物扩增，测序后进行序列比对才能确定。该方法检测时间长，测序费用高，给临床鉴别诊断带来不便。因此，需要一种实验流程简单，节约实验成本，可以快速并准确的区分马梨形虫种类的鉴别方法。

1 材料和方法

1.1 虫体来源

驽巴贝斯虫、马泰勒虫以及两者混合感染阳性样品均来自黑龙江八一农垦大学寄生虫实验室，于-80 ℃保存备用。2016-2020 年间，对黑龙江省不同地点的马属动物无菌采集了抗凝血，共45 份。

1.2 实验试剂

QIAamp Blood Mini Kit 试剂盒 （QIAGEN），2×Taq Mix 酶（南京诺唯赞公司），限制性内切酶Dra Ⅰ（大连宝生物公司）。

1.3 总 DNA 提取

取50 μL 血液样本分别置于1.5 mL 离心管中，用 QIAamp Blood Mini Kit（QIAGEN）试剂盒进行血液DNA 提取，步骤如下：取 20 μL QIAGEN protease于1.5 mL 离心管中，添加200 μL 血液样本，不足200 μL 加入 PBS 补足；加入 200 μL Buffer AL，漩涡震荡混匀后瞬离；在56 ℃条件下孵育10 min，瞬离；加入200 μL 无水乙醇，漩涡震荡混匀，瞬离；将以上得到的液体加入吸附柱中，8 000 r·min-1离心1 min，弃掉2 mL 的收集管；将吸附柱放于新的2 mL 收集管中，加入500 μL Buffer AW1（用之前要加入定量的无水乙醇），8 000 r·min-1离心 1 min，弃掉 2 mL的收集管；将吸附柱放于新的2 mL 收集管中，加入500 μL Buffer AW2，14 000 r·min-1离心 3 min，弃掉2 mL 的收集管；将吸附柱放于新的2 mL 收集管中，空离1 min；将吸附柱放于新的1.5 mL 收集管中，加入 200 μL Buffer AE 或 ddH2O，室温静置 1 min，8 000 r·min-1离心 1 min，收集 DNA。将提取后 DNA 标号并分装，置于-20 ℃冰箱中保存，用于接下来的实验。

1.4 目的基因的扩增

根据GenBank 数据库中不同国家的驽巴贝斯虫和马泰勒虫的18S rRNA 全长序列，用primer premier 5.0 软件设计马梨形虫通用引物，上游引物EP18SF：5′- TGGCTCATTACAACAGT -3′，下游引物EP18SR：5′- GAATAATTCACCGGATC -3′，由哈尔滨擎科生物有限公司合成。以驽巴贝斯虫阳性，马泰勒虫阳性，混合感染阳性血液样本DNA 为模板，扩增18S rRNA 基因序列，PCR 反应体系为 25 μL，10 μL ddH2O，12.5 μL 2×Taq Mix，1 μL DNA 模板和上下游引物各0.5 μL。具体的扩增条件为：95 ℃预变性5 min；进入循环：95 ℃变性1 min，退火温度55 ℃ 1 min，72 ℃延伸 1 min 30 s，共 37 个循环；最后 72 ℃延伸7 min。扩增出的产物在1%琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中拍照。

1.5 PCR-RFLP 方法的建立

使用DNAStar 中的MapDraw 软件对不同国家驽巴贝斯虫和马泰勒虫的序列进行分析，找出两者之间的非保守区以及差异位点，根据分析结果，选择限制性内切酶Dra Ⅰ。将产物与Dra Ⅰ酶混合，体系为2 μL Buffer，17 μL PCR 产物和 1 μL 酶，在 37 ℃条件下以不同时间进行酶切反应，筛选出最佳反应时间。最后根据确定好的反应条件，对采自黑龙江省不同地点的马血液样进行检验。

2 结果与分析

2.1 目的基因扩增结果

用合成的引物EP18SF 和EP18SR 扩增驽巴贝斯虫、马泰勒虫和混合感染样本18S rRNA 基因，PCR 扩增结果显示，驽巴贝斯虫阳性样本、马泰勒虫阳性样本，混合感染样本均在1 500 bp 处出现明亮的条带（图1），说明该对引物可以很好的检测出血液样本中马梨形虫的感染。

图1 马梨形虫18S rRNA 基因PCR 扩增结果Fig.1 PCR amplification results for 18S rRNA gene of equine piroplasm

2.2 PCR 产物的RFLP 鉴定结果

根据驽巴贝斯虫和马泰勒虫18S rRNA 基因序列的软件分析结果，选取限制性内切酶Dra Ⅰ进行酶切鉴定，如图2 显示，该酶的酶切位点为5′ …TTT↓AAA…3′，驽巴贝斯虫18S rRNA 基因上没有该酶的酶切位点，马泰勒虫18S rRNA 基因可被该酶切开，产生两条大小约为350 bp 和1 100 bp 的片段。酶切反应后凝胶电泳显示，驽巴贝斯虫样本未被切开，马泰勒虫样本被切成两条带，与上述大小一致，混合感染样本形成350 bp，1 100 bp 和1 500 bp 的三条带。分别用 15、30、45 min、1 h、1 h 15 min 和 1 h 30 min 对上述马梨形虫18S rRNA 基因的PCR 产物进行酶切反应，由图3 可见，1 h 可达到最佳酶切效果，因此选取1 h 作为酶切反应的时间。

图2 驽巴贝斯虫和马泰勒虫18S rRNA 基因的限制性酶切位点Fig.2 Restriction sites of 18S rRNA gene in Babesia caballi and Theileria equi

图3 不同酶切时间对马梨形虫18S rRNA 基因PCR 鉴别结果的影响Fig.3 Effect of different enzyme digestion time on PCR identification results of equine piroplasma

2.3 临床样本的鉴别结果

对2016-2020 年采自黑龙江省不同地点的45份马梨形虫阳性样本进行PCR-RFLP 鉴定，电泳后成像结果如图4 显示，在45 份样本中，驽巴贝斯虫阳性为15 份，均未被切开；马泰勒虫阳性为36 份，切成大小为350 bp 和1 100 bp 的两条带，其中混合感染为6 份，酶切后均呈350、1 100 bp 和1 500 bp的三条带。结果表明，实验建立的PCR-RFLP 鉴别马梨形虫的方法可以对驽巴贝斯虫、马泰勒虫以及混合感染进行鉴别，并且有较好的适用性。

图4 临床样本PCR-RFLP 鉴别结果Fig.4 Results of PCR-RFLP identification of clinical samples

3 讨论

根据OIE 的统计，马梨形虫病是全球范围内流行的蜱传原虫病[11]，从美国中部、南美、古巴、欧洲南部、亚洲到非洲，经常有马泰勒虫和驽巴贝斯虫的报道，加勒比海地区，其中包括特立尼达岛在内的几个岛屿的马梨形虫感染病例也已经被确认[12-13]。该病的传播方式除了经蜱叮咬传播和马泰勒虫的垂直传播外，医源性血液传播也不容忽视，最典型的例子就是美国佛罗里达州，一批赛马在参加未经批准的马赛前，注射兴奋剂时，针头传染了马梨形虫的阳性血液，导致大量的马出现了明显的临床症状[14]。在我国，一部分养马户对该病的传播方式了解不多，还有针头共用、滥用抗生素的情况存在，不规范的养殖方式会导致疾病的快速传播。而该病临床症状特异性不强，难以与其他疾病区分，对疾病的及时发现和治疗带来不便，给养马业带来了严重的经济损失。因此，增加对该病原体的认识，了解疾病的预防措施与治疗手段是十分重要的。

目前，还没研制出能有效预防感染的疫苗[15]，各地区皆以预防为主。在流行性区域，由于蜱虫的分布活动特性，主要的预防措施便是减少蜱虫与马接触，加强检测，及时诊断治疗病马，实行隔离政策。在非流行性国家，主要以加强监控，控制从疫区进口外来马为主。对于已经感染的马，治疗的原则是早发现，早确诊，早治疗。咪唑苯脲被认为是减轻症状和消除寄生虫最有效的药物[9]，可以治疗驽巴贝斯虫感染，但个别马泰勒虫病例会对其有抗药性[16]。使用时要注意剂量，连续注射或高剂量使用会对动物产生严重损害。驴和骡对三氮脒极其敏感，因此不推荐用此药治疗驴和骡[17]。用三氮脒治疗马梨形虫在临床上也很常见，但该药会对注射部位的肌肉造成严重的损伤，且有些动物会产生呼吸困难和昏睡的不良反应。也有报道说三氮脒只对驽巴贝斯虫有效，无法清除马泰勒虫[18]。土霉素只对马泰勒虫起作用，不能清除驽巴贝斯虫，且目前已不在实践中应用[19]。综上，感染不同种梨形虫，需要用相应的药物根据不同剂量和用法来进行治疗，快速有效鉴别马梨形虫的种类，可以指导临床用药，为马梨形虫病的防治提供基础。

马梨形虫病的诊断方法有很多，包括形态学方法、免疫学方法和分子生物学方法。其中，形态学方法包括血涂片染色镜检法和淋巴结穿刺检测法，但由于形态学方法敏感性低、准确性低，并不能适用于虫种的鉴别检测。血清学中，补体结合试验是传统血清学检验方法，但方法的操作过程复杂，荧光抗体的成本较高，目前应用极少。ELISA 方法是世界动物卫生组织推荐的检测马梨形虫的参考方法[11]，有较好的灵敏性与准确性，在生命科学各领域得到广泛应用。但方法对实验操作要求高，并且随着虫种不同基因亚型的发现，该方法也不完全适用。PCR 作为分子生物学的常规诊断方法，现在已成为检测马梨形虫病比较常规的方法，目前已建立的检测马梨形虫PCR方法较多，不同的方法引物可能不同，其目的基因分别 有 p82、RAP1、EMA1、EMA2、Bc48、Bc134 和 18S rRNA 等。但对于鉴别虫种，还需要用不同的特异性引物扩增，经过测序、序列比对后方能确定，这种方法检测时间长，测序费用高，不适用于田间检测[20]。

PCR-RFLP 是对等位特异性基因位点进行PCR扩增后，通过酶切PCR 产物电泳后获得限制性片段的一种方法，目前已经的应用于寄生虫虫种的分类鉴定上。对于原虫的鉴别，张龙现等已经成功建立了鉴别人畜隐孢子虫种类的PCR-RFLP 方法[21]；贾西帅等建立的PCR-RFLP 方法可以直接鉴别出恶性疟、三日疟、间日疟和卵形疟血样（包括curtisi 亚种和wallikeri 亚种）[22]；徐宗可等建立的PCR-RFLP 方法可鉴定莫氏巴贝斯虫、吕氏巴贝斯虫、尤氏巴贝斯虫、绵羊巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种这几种感染羊的梨形虫[23]。综上，马梨形虫不同虫种的鉴别，也可通过这种方式实现。实验的结果表明，PCR-RFLP 鉴别驽巴贝斯虫和马泰勒虫的方法简单、快速、节约成本，可以进行准确鉴别。

4 结论

在研究中，建立的PCR-RFLP 方法可以很容易根据酶切后条带的大小以及数量，将不同种类的马梨形虫进行鉴别。鉴别方法操作简单，快速鉴别仅需0.5 个工作日，在保证高效率的同时还省去了测序费用，保证了低成本。进行临床样本检测后可以发现，不同个体之间，保持着很高的稳定性。方法可为鉴别马梨形虫虫种，防控马梨形虫病提供有效的技术支持。