富硒大豆蛋白肽对小鼠免疫及抗氧化功能的影响

何晓蕾，任春元，王孟雪

（黑龙江八一农垦大学，大庆 163319）

硒是维持机体正常生理功能的重要组成元素，目前，多数研究表明，人体缺乏硒容易引发如癌症、克山病、脱发等疾病，因此，密切关注体内硒的摄入量至关重要。硒是人体内GSH-Px 酶的活性中心，参与细胞内酶促反应，催化过氧化物分解，防止脂质过氧化，提高机体抗氧化能力[1-2]，与此同时，其具有增强非特异性免疫、吞噬细胞的存活率，提高抗体水平和细胞免疫功能[3-4]。据报道，因地域和自然环境的影响我国人均硒摄入量不足，部分人群处于硒缺乏的状态[5]，开发富硒产品变得尤为迫切。为短时间内解决区域性硒元素短缺情况，通过制备富硒强化食品和农产品来提高人均硒摄入量，增强人体免疫，具有广阔的开发空间。

大豆是世界上重要的经济作物之一，在我国北方广泛种植，是重要的农产粮食作物。其含有高达45%的大豆蛋白质，25%的脂肪，只有近5%的淀粉。大豆不只作为油的提取原料，亦可为人类日常所需提供优质蛋白。大豆肽是以大豆蛋白为原料，当大豆中的大分子蛋白质经酶水解后、纯化可得到易被人体消化吸收的大豆蛋白肽。大豆蛋白肽能够保护人体健康，预防某些类型的癌症、降低胆固醇、降低血脂血压、清除体内自由基，有效地维持机体机能，对人体器官也有保护的作用，近年来学者对此方面功能性的研究也颇感兴趣。

硒主要有两种形态，无机态硒和有机态硒[6]，但无机态硒不易被人体快速吸收，且就人体而言，无机态硒摄入后对身体健康有毒害，而有机态硒则是提供人体有效硒元素的主要途径。目前，随着人们对健康饮食习惯理念的执着追求，消费者更倾向于直接从日常食物中获取硒元素。王凤杰等[7]研究表明，富硒大豆蛋白能提高小鼠的抗疲劳能力，增强抗氧化酶的活力[7-8]、促进免疫器官的发育、抑制肿瘤的生长[9]，且无毒副作用，是一种优质的硒补充剂。富硒大豆肽能缓解大鼠氧化应激损伤，提高GSH-Px、SOD 活性、降低MDA 含量[10-11]。由此可见，硒的诸多重要生物学功能都是通过硒蛋白来实现的，也能够被人体吸收维持生长代谢。但是，当前有关富硒大豆蛋白以及蛋白肽的研究大都集中在制备、简单的理化性质测定、毒理性及抗氧化性等功能性的研究，对于东北富硒大豆蛋白肽的生理活性研究相对较少。故而，研究将东北黑土地大豆作为富硒的中间载体，通过亚硒酸钠溶液对大豆浸泡和萌发的过程，实现大豆富集和生物转化，制备得到富硒大豆，用蛋白酶对富硒大豆蛋白进行酶解，制备富硒大豆肽，同时，将普通市售大豆为参照组，测定其体内的抗氧化活性、免疫功能性的变化，以期为硒元素的富集与转化提供理论支撑，为拓宽品种丰富的富硒大豆食品、农作物加工产品和口服液产品新途径奠定前期研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

具体实验材料试剂见表1。

表1 实验用试剂Table 1 Reagents for experiments

1.2 仪器与设备

实验仪器设备见表2。

表2 实验用仪器设备Table 2 Instruments used in this study

1.3 实验方法

1.3.1 富硒大豆肽的制备

经过前期单因素及正交预实验获得制备富硒大豆的最优工艺。内容如下：称取颗粒饱满、无虫蛀、无霉烂的富硒大豆样品200 g，采用浓度为50 μg·L-1亚硒酸钠溶液30 ℃浸泡48 h，得到芽长为2 mm 的富硒大豆。对照组为市售大豆样品200 g，处理方式同实验组样品一样。将上述样品烘干、粉碎、过100 目筛备用。

采用碱提酸沉法制[12]备富硒大豆蛋白，分别称取上述富硒大豆粉和普通大豆粉各 10 g，按 1∶10（m·v-1）加入去离子水混合搅拌，用1 mol·L-1的NaOH 溶液调 pH 至 10，料液比为 1∶9 搅拌 20 min，4 500 r·min-1离心 8 min，上清液 pH 调至 4.6，4 500 r·min-1离心8 min，蒸馏水溶解沉淀透析24 h 后冷冻干燥备用。

富硒大豆蛋白肽的制备，石油醚脱脂烘干，中性蛋白酶水解后，15 min 沸水域灭酶，透析24 h 即制得富硒大豆蛋白肽，纯度88.45%。

1.3.2 大豆肽硒含量的检测

取样品0.2 g 置于锥形瓶中，加10 mL 硝酸和高氯酸的混合液消化24 h 后，用电热板加热并补加硝酸直到剩余体积为2 mL 左右，加5 mL 6 mol·L-1盐酸溶液后加入 2.5 mL 铁氰化钾溶液（100 g·mL-1）定容混匀待测。样品测定条件为硒空心阴极灯，进样条件，样品体积：2 mL，95 mA 电流，载气流量 500 mL·min-1，利用标准曲线法计算硒含量。

1.3.3 动物实验分组及给药

动物实验分为3 组，每组10 只小鼠，根据《保健食品功能学评价程序和检验方法-2003》拟定给药剂量[12]将制得的富硒大豆肽进行小鼠实验，基础饲喂7 d 后连续灌胃给药30 d。

表3 功能实验分组Table 3 Groups of function test

1.3.4 生长指标的测定

小鼠停药后隔天致死，准确称取以下各项指标，按公式1 和公式2 分别计算脾脏和胸腺指数。

1.3.5 抗氧化酶活性的测定

按照SOD 和GSH-Px 试剂盒说明书的操作规定，检测小鼠肝脏组织和血清匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。

1.3.6 小鼠体液免疫能力的测定

（1）小鼠巨噬细胞增殖能力的测定

采用WST-1 法检测细胞增殖：无菌环境中取出末次给药1 h 后处死的小鼠腹腔巨噬细胞悬液，离心后于37 ℃ DMEM 培养基中培养2 h，450 nm 处测定吸光值[13]。

（2）吞噬能力的测定

静脉注射印度墨汁于小鼠尾（10 mg·kg-1），在2 min 和 10 min 时取 20 μL 的眼血于 3 mL 0.1%的Na2CO3溶液中，600 nm 处测定吸光值（OD）。分别取肝脏及脾脏称重，计算小鼠吞噬指数A[12]。

式中：A 为吞噬指数；m 为小鼠体重（g）；m0为小鼠肝重（g）；m1为小鼠脾重（g）；OD1为 2 min 时吸光值；OD2为 10 min 时吸光值。

（3）小鼠免疫球蛋白水平的测定

按照IgA、IgG 试剂盒说明书检测小鼠血清及肝脏中免疫球蛋白含量。

1.3.7 数据处理

采用SPSS 20 软件进行数据处理分析。

2 结果与分析

2.1 大豆肽硒含量的检测

利用亚硒酸钠溶液浸泡大豆制备富硒大豆，操作简便，简化繁琐种植程序，并可节约成本，提高大豆中硒的富集率。东北大豆肽中硒的含量由表4 可知，普通大豆总硒含量为 16.53 μg·g-1，而经过亚硒酸钠浸泡后的富硒大豆总硒含量为26.25 μg·g-1；普通大豆蛋白总硒含量40.25 μg·g-1，富硒大豆是42.28 μg·g-1；普通大豆肽总硒含量 5.67 μg·g-1，富硒大豆肽总硒含量14.37 μg·g-1。由此可见亚硒酸钠可实现大豆硒含量的有效富集，提高大豆营养成分。但是，通过硒含量的变化数据可以看出，在提取大豆肽时，硒含量也会随着纯化过程而随之减少了12 μg·g-1，为缓解大豆肽中硒含量的减少应在后续的研究中不断优化提取工艺。

表4 大豆肽硒含量Table 4 Selenium content

2.2 富硒大豆肽对小鼠生长性能的影响

2.2.1 富硒大豆肽对体重指数的影响

利用实验室制备的富硒大豆蛋白肽饲养小鼠，研究富硒大豆蛋白肽对小鼠生长性能的影响。结果表明，实验期间小鼠精神状态良好，未表现神经及其他系统的中毒现象，说明不同剂量组富硒大豆肽对小鼠无毒副作用。图1 为灌胃富硒大豆肽的小鼠体重的变化数值，与普通小鼠相比，随着富硒大豆蛋白肽含量的增加，SH 和SM、SL 三组的小鼠体重数值也随之增加，其中SH 组小鼠体重增长最为显著，体重数值为32.22 g。通过小鼠体重的变化，不难发现，富硒大豆肽可以提高小鼠的代谢能力，满足其生长必须的微量元素，促进其健康生长。

图1 富硒大豆肽对小鼠体重的影响Fig.1 Effect of selenium-enriched soybean peptide on mice's weight

2.2.2 富硒大豆肽对免疫器官指数的影响

胸腺和脾脏作为重要的免疫器官之一，参与机体免疫调节，其中胸腺作为一级免疫器官，其不仅促进T 淋巴细胞的分化与成熟，同时也分泌胸腺素，参与机体的细胞免疫；脾脏是一种含有大量淋巴细胞和巨噬细胞的外周免疫器官[13-14]，二者可反映机体免疫功能的强弱。图2 为富硒大豆蛋白肽对小鼠免疫器官指数的影响，由图可知，与对照组相比，不同剂量组的大豆富硒肽样品对小鼠免疫器官指数存在明显差异，中、高剂量组可显著提高小鼠（P＜0.05）免疫器官指数，其中高剂量组胸腺指数和脾脏指数分别为0.51%和0.31%。这表明东北大豆肽中硒含量愈高，愈可被小鼠吸收，其免疫能力就有所提高，这可能与小分子肽易于小鼠对硒元素的吸收有关。

图2 大豆富硒肽对小鼠免疫器官指数的影响Fig.2 Effect of selenium-enriched soybean peptide on immune organ index in mice

2.3 富硒大豆肽对小鼠生体内抗氧化活性的影响

2.3.1 血清、肝脏中SOD 活性

机体代谢过程中随时都在发生氧化反应，产生的自由基需要及时清除，在体内积聚过多便会损伤机体。SOD 是人体内抗氧化酶防御体系中最重要的酶之一，能较好的清除O2-，降低或阻止O2-对机体细胞和组织的损害[15-16]，保护细胞不受自由基的破坏。大豆富硒肽对小鼠血清、肝脏中SOD 活性的影响如图3 所示。与参照组相比，低、中、高剂量组均显著提高（P＜0.05）肝脏中的 SOD 值，最高值可达 223.5 U·g-1；而SM、SH 组血清的SOD 值升高较显著，SOD 活性明显提高，数值在 147.6 U·g-1到 152.3 U·g-1之间。肝脏和血清中SOD 值的增加说明富硒大豆肽能够清除体内的自由基，具有较好的抗氧化、清除自由基的能力；蛋白肽中的硒含量越多，抗氧化能力越强。

图3 富硒大豆肽对小鼠血清、肝脏中SOD 活性的影响Fig.3 Effect of selenium-enriched soybean peptide on activity of SOD in serum and liver of mice

2.3.2 血清、肝脏中GSH-Px 活性

血清和肝脏中GSH-Px 含量是衡量机体抗氧化应激能力的关键指标之一[17]，与SOD 相同都是机体中重要的抗氧化活性组分，既能保护许多蛋白和酶等分子中的巯基，并能保护细胞膜结构和功能完整，防止免疫细胞或组织的损伤[18]，能有效保持细胞的稳定性，从而保护细胞结构，其含量的升高表明机体清除氧自由基的能力增强[19]。由图4 GSH-Px 活性的数值变化可以看出，富硒大豆肽低、中、高剂量组较参照组血清中的GSH-Px 活性均明显增强，数值分布在896.4～986.3 U·g-1之间；肝脏中的 GSH-Px 活性在中、高剂量组增加的较明显，最高可达1 100.7 U·g-1。这表明富硒大豆肽含量的多少对血清的抗氧化性影响较大，在肝脏中则需要相对较高浓度的富硒大豆蛋白肽方能提高其抗氧化性能。

图4 富硒大豆肽对小鼠血清、肝脏中GSH-Px 活性的影响Fig.4 Effect of selenium-enriched soybean peptide on activity of GSH-Px in serum and liver of mice

2.4 富硒大豆肽对小鼠体液免疫的影响

2.4.1 富硒大豆富硒肽对小鼠巨噬细胞增殖能力的影响

RAW264.7 细胞属于巨噬细胞的一种，参与体液免疫，其吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的重要指标之一，当病原体入侵或自身组织出现病理性改变时，它能激活机体的免疫系统，通过细胞内杀伤作用消灭抗原[12]。富硒大豆肽对小鼠巨噬细胞增殖能力的影响如图5 所示，随着富硒大豆蛋白肽含量的增加，小鼠的巨噬细胞增值能力持续增强，当富硒蛋白肽含量最高时，小鼠体内最大A490 值为0.61，表明小鼠免疫力作用有所提高，体液免疫能力增强。

图5 富硒大豆肽对小鼠巨噬细胞增殖能力的影响Fig.5 Effect of selenium-enriched soybean peptide on macrophage proliferation in mice

2.4.2 富硒大豆富硒肽对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响

巨噬细胞通过吞噬侵入的病原体及体内衰老、畸变的细胞进而提高机体的免疫能力，其吞噬能力的大小可以间接反映机体巨噬细胞的吞噬能力和机体的非特异性体液免疫水平[21]。小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响与富硒大豆肽之间的关系如图6 所示，对照组的吞噬指数是16.5%，富硒大豆肽含量的增加使得SL、SM、SH 三组小鼠吞噬细胞的吞噬指数较普通对照组明显增加，高剂量组小鼠的吞噬指数为19.8%。这表明富硒大豆肽可以通过提高小鼠巨噬可促进巨噬细胞吞噬能力和增殖能力，增强巨噬细胞对机体的体液免疫能力水平。

图6 富硒大豆肽对小鼠吞噬指数的影响Fig.6 Effect of selenium-enriched soybean peptide on mice's phagocytic index

2.4.3 富硒大豆富硒肽对小鼠免疫球蛋白水平的影响

免疫球蛋白是存在于动物血液及某些细胞的表面上，具有抗体活性[22]，在测定体液免疫活性时，常用血清免疫球蛋白来证明体液免疫功能的强弱。IgG 代表着血清主要的抗体成分、IgA 可通过抑制微生物在呼吸道上皮附着，阻碍病毒繁殖，防止病原体入侵对机体造成伤害，二者作为衡量小鼠体液免疫功能情况的指标。富硒大豆肽对小鼠免疫球蛋白水平的影响如图7 所示，SL、SM 组的免疫蛋白活性IgA 值与参照组相比，变化不显著，SH 组变化相较于其他组变化明显，为278 mg·L-1，这可以看出是与富硒大豆蛋白肽中的硒含量有关，可提高小鼠免疫能力。与此同时，随着富硒大豆肽剂量的增多，免疫球蛋白IgG 数值变化平稳增加，高剂量组IgA 值为490 mg·L-1。综合两种数值，不难看出富硒大豆肽对小鼠免疫蛋白有一定的影响，随着其增加，免疫活性增加，抵抗能力增强。

图7 大豆富硒肽对小鼠体液免疫功能的影响Fig.7 Effect of selenium-enriched soybean peptide on mice's humoral immunity

3 结论

实验通过碱提酸沉法制备富硒大豆蛋白，经过蛋白酶水解和纯化得到富硒大豆蛋白肽，测定了东北富硒大豆蛋白肽中总硒的含量为14.37 μg·g-1。随着富硒大豆肽含量增加，小鼠抗氧化活性指标SOD和GSH-Px 值也在不断增加，最高值血清SOD 为152.3 U·g-1，GSH-Px 为 986.3 U·g-1；肝脏 SOD 为223.5 U·g-1，GSH-Px 为 1 100.7 U·g-1。结果表明，富硒大豆肽可提高小鼠清除自由基提高抗氧化的能力。通过对小鼠体液免疫指标如巨噬细胞增殖能力、巨噬细胞吞噬能力、免疫球蛋白IgA，IgG 的测定，可以看出富硒大豆蛋白肽能够提高体液免疫系统的防御能力，维持机体的健康环境。研究对比不同灌胃剂量富硒大豆蛋白肽的小鼠生长性能，如体重指数、免疫器官指数的测定，及对小鼠体液免疫的研究证实，硒依托大豆肽为载体，易于被小鼠吸收，促进生长代谢，显著提高抗氧化能力和体液免疫水平，后续研究中可以考虑探究满足其生长所需的富硒大豆蛋白肽最佳含量，为人体科学合理补硒奠定理论基础。