美金刚对老龄小鼠术后认知功能和焦虑抑郁情绪的影响

王小明，张立新，习建华

美金刚胺是一种N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）拮抗剂，大量研究证实其可改善阿尔茨海默氏病（AD）模型动物的认知功能[1-2]，临床试验也支持其用于治疗中、重度AD[3-4]。研究表明，术后认知功能紊乱（PND）动物的海马中同样能够观察到Tau蛋白磷酸化和-淀粉样蛋白沉积[5-6]，提示PND具有与AD相似的发病机制。此外，术后疼痛、睡眠剥夺和心理因素等常导致患者出现焦虑、抑郁情绪，而动物和临床研究均提示了美金刚胺良好的抗抑郁、抗焦虑作用。本研究使用老龄小鼠进行腹腔探查手术以建立PND动物模型，联合使用多种认知和情绪行为学方法，观察美金刚对老龄小鼠术后认知功能和焦虑抑郁情绪的影响。报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物和分组 本研究获得宁波大学实验动物伦理委员会审查批准（AEWC-2018-12）。12～14个月龄雄性清洁级ICR小鼠30只，购自浙江省医学科学院实验动物中心。将动物随机分为3组（n=10）：假手术组（F组），小鼠接受安慰剂治疗4周，然后进行假手术；手术组（S组），接受安慰剂治疗4周，然后进行剖腹手术；实验组（A组），接受盐酸美金刚治疗4周，然后进行腹腔探查手术。

1.2 麻醉方法与围术期管理 采用七氟烷小动物麻醉机（瑞沃德公司，深圳），七氟烷浓度调节至3%，将小鼠放入诱导箱内进行麻醉诱导，直至小鼠入睡，翻正反射消失。麻醉维持期，小鼠通过面罩持续吸入2%七氟烷，控制麻醉维持时间为0.5 h。

1.3 腹腔探查模型 于右肋下垂直于肋骨做一纵行切口，长约1 cm，切口深至腹腔内。戴有无菌外科手套的手指伸入腹腔内进行探查约30 s，取出约10 cm的小肠至腹腔外，进行摩擦约30 s，反复该操作3次。用消毒器械和外科缝合线缝合伤口，切口处以0.5%罗哌卡因浸润镇痛并涂抹红霉素预防感染。整个麻醉手术过程控制在15 min内，结束麻醉后待小鼠自然清醒。假手术组小鼠接受同样时长的麻醉而不进行手术。

1.4 行为学测试 术后第7天开始行为学测试，根据应激程度的大小，实验顺序为新物体识别实验（NOR）、高架十字迷宫测试、悬尾实验和条件性恐惧实验（FC），见封三彩图1。

1.4.1 NOR 第1天，将A、B两相同物体放入旷场箱内，让小鼠进行探索、训练5 min；第2天，将B物体换为不同形状、质地的物体C，记录小鼠5 min内对两物体的探索时间（T），并计算辨别指数（RI）=TC/（TA+TC）。

1.4.2 高架十字迷宫测试 高架十字迷宫由两条开臂和两条闭臂组成，互相垂直呈十字交叉，臂宽5cm，臂长35cm，闭臂高15cm，迷宫离地高度55cm。将小鼠面对闭臂放置于十字迷宫的中央正方形内，让其自由探索10min。进入开臂或闭臂的定义是四肢均进入该臂，记录开臂进入次数和开臂停留时间。焦虑样行为表现为进入开臂的次数减少以及在开臂上停留的时间减少。

1.4.3 悬尾实验 矩形盒子的顶部放置一悬挂杆用于悬挂小鼠的尾巴。用一条粘性胶带粘贴在尾巴的末端，将小鼠悬挂在盒子的中间持续6 min。小鼠鼻子与仪器底板之间的距离为15 cm。记录每只小鼠静止不动的时间。缺乏与逃逸相关的行为被认为是静止不动，反映抑郁样行为。逃逸相关的行为包括试图攀爬悬挂杆，身体强烈晃动以及四肢运动。仅限于前腿但没有后腿牵扯的小动作不算作活动。

1.4.4 FC 小鼠在无声黑暗试验箱内适应3 min后，给予单一高频声音（30 s，70 dB，3 kHz）刺激，随后给予足底电击（2 s，0.7 mA）刺激，刺激结束后恢复30 s，循环2次后放回饲养笼。训练结束后24 h，将小鼠再次放入实验箱内自由探索3 min，不给予任何刺激，记录场景诱发僵直，主要反映海马依赖性恐惧记忆；2 h后放入改造后实验箱（白色分隔板遮住通电栅栏，改变四周箱壁颜色），自由探索3 min后，给予上述相同声音刺激3 min，记录线索诱发僵直，主要反映非海马依赖性恐惧记忆。

1.5 美金刚给药 A组小鼠每天管饲法给予美金刚盐酸盐（Lundbeck公司，丹麦）20 mg/kg[1]，持续4周。F组和S组通过管饲法给予等体积0.9%氯化钠注射液，同样持续4周。

1.6 统计方法 数据分析和作图采用Graphpad prism 7.0软件处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，bonferroni法行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NOR实验 3组小鼠RI差异有统计学意义（F=7.42，P＜0.01），S组RI低于F组（t=3.84，P＜0.01），A组与S组的RI差异无统计学意义（t=2.16，P＞0.05）。见封三彩图2a。

2.2 悬尾实验 3组小鼠不动时间差异有统计学意义（F=24.39，P＜0.01），S组不动时间大于F组（t=6.76，P＜0.01），A组不动时间小于S组（t=4.90，P＜0.01）。见封三彩图2b。

2.3 高架十字迷宫测试 3组小鼠开臂停留时间和开臂进入次数差异均有统计学意义（F=24.85、66.32，均P＜0.01）。S组开臂停留时间短于F组（t=7.05，P＜0.01），A组开臂停留时间长于S组（t=3.54，P＜0.01）。S组开臂进入次数少于F组（t=11.45，P＜0.01），A组开臂进入次数多于S组（t=4.67，P＜0.01）。见封三彩图2c、d。

2.4 FC实验 3组小鼠场景诱发僵直时间差异有统计学意义（F=8.22，P＜0.01），S组的僵直时间低于F组（t=3.87，P＜0.01），A组的僵直时间高于S组（t=3.00，P＜0.05）。3组小鼠的线索诱发僵直时间差异有统计学意义（F=7.49，P＜0.01），S组的僵直时间低于F组（t=3.22，P＜0.01），A组僵直时间高于S组（t=3.47，P＜0.01）。见封三彩图2e、f。

3 讨论

基于中枢神经炎症是PND发生发展的重要机制，药物领域的研究主要集中于抗炎药物，如小剂量氯胺酮的抗炎作用[7]、米诺环素对小胶质细胞的抑制作用[8]以及非甾体类抗炎药物[9]等。本研究发现可有效治疗AD的NMDAR拮抗剂美金刚对术后认知功能同样具有保护性作用。本研究选择了NOR实验和FC实验来评估小鼠的认知功能，结果发现，美金刚能够有效缓解手术创伤所致的小鼠恐惧记忆障碍，但是并不能改善物体识别记忆。笔者认为，手术创伤影响的认知功能涉及多个方面，累及的相关脑区也存在差异性。美金刚的作用靶点可能不包括编码物体识别记忆的相关脑区。

研究表明，中枢神经炎症也可导致神经退行性改变，如Tau蛋白的过度磷酸化，细胞因子诱导的谷氨酸兴奋毒性以及-淀粉样蛋白沉积[5-6]。中枢神经系统中促炎细胞因子的释放导致谷氨酸水平上调和NMDAR活性的增加，在病理状态下Ca2+通过离子通道大量流入从而导致NMDARs过度兴奋，最终导致神经元死亡。此外，NMDARs的过度活化也与Tau毒性有关[10]。上述过程是AD和PND发生、发展的共同分子机制[5]。虽然尚无直接证据，笔者推测美金刚可能是通过阻断Ca2+离子通道抑制NMDAR介导的谷氨酸能兴奋性毒性和Tau蛋白磷酸化，从而减轻手术创伤所致的认知功能减退。

术后认知功能的临床研究和基础研究之间存在着“鸿沟”[11]。临床研究中对于PND的诊断通常采用多维度多种类的评估量表，对患者的记忆力、注意力、执行力、语言理解能力和信息处理等多方面的认知和记忆能力进行综合评估[12-13]。但是利用动物模型进行的临床前基础研究大多集中于海马依赖的学习记忆，而忽视了认知的其他方面。鉴于外科手术后伴随的疼痛、引流管不适、睡眠剥夺等不良因素常导致患者出现不同程度的焦虑和抑郁情绪，因此本研究通过高架十字迷宫和悬尾实验评估小鼠的焦虑抑郁情绪。研究结果显示，腹腔探查术后7 d，小鼠表现出显著的焦虑、抑郁样行为。先前研究证实了竞争性NMDAR拮抗剂的抗焦虑作用相比苯二氮卓类药物或巴比妥类药物更为有效[14]。针对美金刚的动物和临床研究均提示了美金刚胺良好的抗抑郁、抗焦虑作用[15-16]。本研究中美金刚对于小鼠腹腔探查手术所诱导的焦虑抑郁情绪同样具有有效的抑制作用。然而，目前尚缺乏临床证据支持美金刚对PND患者情绪方面的缓解作用，值得进一步探讨和研究。

综上所述，美金刚能够改善老龄小鼠手术创伤导致的认知功能减退和焦虑、抑郁情绪。