核受体结合SET域蛋白1催化活性区域B细胞优势表位的预测与分析

陈旭东

组蛋白赖氨酸甲基化酶（HMTases）可以催化组蛋白的甲基化，参与多种生物学事件，对DNA复制、DNA损伤应激、细胞周期循环、胞质分离及转录调节等多方面有重要作用[1]。HMTases可以特异性地将甲基从s-腺苷甲硫氨酸（AdoMet）转移到组蛋白末端的几个特定的赖氨酸[2]。核受体结合SET域蛋白家族（NSDs）是HMTases中的一支亚家族，包括NSD1、NSD2（MMSET/WHSC1）和NSD3（WHSC1L1），都包含具有催化活性的SET结构域，该结构域高度保守[3]。NSD1、NSD2及NSD3在小鼠发育中是必须的，敲除NSD1及NSD2的基因会导致小鼠死亡[4]。研究表明，NSDs的突变和扩增与多种发育异常疾病和肿瘤相关[5-6]。NSD1的SET结构域可以特异性地催化H3K36[7]。NSD1的异常表达及活性改变和多种肿瘤有关。现已有多项研究以甲基化酶为靶标，开发抑制药物，以期待治疗相应的疾病[8-9]。本研究拟预测NSD1催化活性区域（NSD1-CD）的B细胞优势表位，来为应用多肽小片段制备单克隆抗体、表位疫苗及研究其蛋白功能提供重要的依据。报道如下。

1 资料与方法

1.1 NSD1-CD段氨基酸序列的获取 NSD1全长氨基酸序列检索于uniProt蛋白质数据库（http://www.uniprot.org/），NSD1-CD段的范围参考Qiao等[10]研究。

1.2 NSD1-CD蛋白的二级结构获取 自PDB数据库（https://www.rcsb.org/）获取NSD1-CD（PDB ID 300I）的三级结构，使用蛋白质二级结构词典DSSP（Definition of Secondary Structure of Proteins，DSSP）获取其二级结构。

1.3 NSD1-CD蛋白亲水性、极性、抗原性和表面可及性的预测 利用EXPASY服务器提供的亲水性参数（Hopp&Woods）、极性参数（Zimmerman）和DNAstar软件的Protein进行的表面可及性参数（Emini）、抗原性参数（Jameson-Wolf）和柔韧性参数（Karplus-Schulz）方法来对NSD1-CD蛋白B细胞表位进行预测。

1.4 综合分析 综合以上预测方法，兼顾各项预测参数推断NSD1蛋白B细胞表位，采用吴玉章等[11]建立的抗原性指数（AI）综合评判NSD1-CD B细胞表位的优势区域。

1.5 结合蛋白质三级结构分析 在PYMOL软件上标出优势表位在NSD1-CD上的位置，在uniProt蛋白质数据库网站上通过Structure模块的Toggle controls panel工具进行测距。

2 结果

2.1 NSD1-CD的氨基酸序列 NSD1全长为2 696个氨基酸（长型），相对分子质量为296.65 kDa。NSD1-CD的范围是1 852～2 082，其中包含3个结构域：PRE-SET（AWS）1 890～1 940，SET 1 942～2 059，POST-SET 2 066～2 082；长为231个氨基酸，相对分子质量为26.53 kDa，具体序列如下：KELRQLQEDRKNDKKPPPYKHIKVNRPIGRVQIFTADLSEIPRCNCKATDENPCGIDSECINRMLLYECHPTVCPAGGRCQNQCFSKRQYPEVEIFRTLQRGWGLRTKTDIKKGEFVNEYVGELIDEEECRARIRYAQEHDITNFYMLTLDKDRIIDAGPKGNYARFMNHCCQPNCETQKWSVNGDTRVGLFALSDIKAGTELTFNYNLECLGNGKTVCKCGAPNCSGFLG。

2.2 NSD1-CD的二级结构 自PDB获取NSD1-CD的三级结构，使用蛋白质二级结构词典DSSP获取其二级结构，提示NSD1-CD蛋白的二级结构中以无规卷曲为主-螺旋、-转角相对较少。可见无规则卷曲主要位于NSD1全长N端的1 865～1 870、1 879～1 887、1 893～1 910、1 917～1 926、1 940～1 943、1 949～1 953、1 959～1 966、1 992～1 997、2 022～2 026、2 045～2054及2 057～2082。见封二彩图1和表1。

表1 NSD1-CD的二级结构的构成比 例（%）

2.3 多参数预测NSD1-CD蛋白表位 按照Hopp＆ Woods、Zimmerman、Jameson-Wolf、Karplus-Schulz及Emini方案分别预测NSD1-CD蛋白的亲水性、极性、抗原性、柔韧性和表面可及性。其中高于阈值的肽段即为预测的抗原表位（抗原指数≥0，亲水性指数≥0，表面可及性指数≥1，极性指数≥12）。综合分析NSD1-CD的亲水性、极性、柔韧性、表面可及性和抗原性显示：应用不同参数预测的B细胞抗原表位肽段略有差异，但位于N端的1 856～1 870，1 900～1 902，1 938～1 942，1 957～1 964在多种预测方法中一致。见封二彩图2和表2。

表2 NSD1-CD亲水性、极性、柔韧性、抗原性、表面可及性等参数的预测结果

2.4 NSD1-CD蛋白表位的综合预测 综合以上预测方法及AI计算方法，计算NSD1-CD的B细胞表位平均AI，结果显示人NSD1-CD的1 865～1 869、1 959～1 964平均AI较高，提示其可能为B细胞表位的优势区域。见表3。

表3 NSD1-CD B细胞表位的平均抗原性指数

2.5 结合蛋白质三级结构分析 自PDB获取NSD1-CD（PDB ID 300I）的三级结构文件，通过PYMOL标记出SET结构域和优势表位的位置，可见SET结构域形成了一个“口袋”状结构，口袋中即为其活性区域，内侧可容纳一个AdoMet，可催化其转移甲基至组蛋白上。优势表位KTDIKK（1 959～1 964）位于SET结构域上，但位于“口袋”的外侧底部，距离活性区域较远（封二彩图3a）。而优势表位KKPPP（1 865～1 869）位于PRE-SET（AWS）上，在“口袋”的“口”附近（封二彩图3b）。在uniProt蛋白质数据库网站上通过Structure模块的Toggle controls panel工具进行测距，测量1 961号天冬氨酸（位于优势表位KTDIKK的中央）和AdoMet的距离，结果为24.22Å（封二彩图4a），测量1 867号脯氨酸（位于优势表位KKPPP的中央）和AdoMet的距离，结果为13.25Å（封二彩图4b）。

3 讨论

使用生物信息学预测B细胞表位是现如今广泛使用且高效方便的方法[12-13]，目前有多种B细胞表位的预测方法，但由于各种方法的差异性及局限性，不同方法预测的表位差异较大，故研究人员正不断地改进与完善预测评价体系，使B细胞表位的预测、评价标准化。目前得到公认的具有较好预测结果的方法有二级结构、亲水性、抗原性、表面可及性等参数的预测，本研究将以上参数与吴玉章等[11]建立的AI相结合，从而初步地做出科学、合理的预测分析。

由于NSD-1蛋白的甲基转移活性主要是通过SET结构域实现的，本研究通过截取其中的一部分（NSD-CD），包括包含三个结构域（PRE-SET 1 890～1940，SET1 942～2 059，POST-SET2066～2082），从而减少预测的难度。用多种方法对其B细胞表位进行预测，最终得到了2段优势B细胞表位，分别位于N端的1 865～1 869及1 959～1 964，其中优势表位KTDIKK（1 959～1 964）位于SET结构域上，但是距离AdoMet所在的活性区域较远，1 961号天冬氨酸（位于优势表位KTDIKK的中央）和Ado-Met的距离为24.22Å，影响其活性的可能性较小；而优势表位KKPPP（1 865～1 869）位于PRE-SET（AWS）上，且距离AdoMet所在的活性区域较近，在uniProt蛋白质数据库网站上通过Structure模块的Toggle controls panel工具进行测距，测量1 867号脯氨酸（位于优势表位KKPPP的中央）和AdoMet的距离，结果为13.25Å，对SET结构域的甲基转移活性有影响的可能性较大。

在Qiao等[10]的研究中，POST-SET结构域如同一个“盖子”，覆盖在SET结构域的活性区域表面，被认为对其活性有重要作用，具有作为药物靶点的可能。但本研究显示POST-SET段亲水性及表面可及性较弱，难以预测出优势B细胞表位。本研究成功预测了NSD1的B细胞优势表位，为应用多肽小片段制备单克隆抗体、表位疫苗及研究其蛋白功能提供重要的依据。