香叶木苷对异丙肾上腺素诱导的大鼠心脏功能紊乱和氧化应激的影响及其分子机制

耿栋栋 苏淑红 杜慧清 王志方

1 新乡医学院，河南 新乡 453000；2新乡市中心医院 特需病房，河南 新乡 453000；3新乡市中心医院 急诊科，河南 新乡 453000；4新乡市中心医院 心血管内科三病区，河南 新乡453000

根据世界卫生组织的报告，全世界每年有1 200万人死于心肌损伤。尽管过去几十年来通过药物和机械干预在心肌损伤的治疗方面取得了进展，但心肌损伤仍是死亡的主要原因。已经确定，损伤程度的限制是减少心肌损伤后果的一个重要因素[1]。心肌缺血和心肌缺血再灌注后，活性氧的产生增加。研究[2]表明，活性氧在心肌损伤的发展中起关键作用。异丙肾上腺素通过诱导氧化应激、心肌损伤和心肌细胞能量储备的耗竭，引起复杂的生化和结构变化，导致细胞损伤和坏死[3]。香叶木苷是一种不饱和黄酮，主要存在于牛膝草和迷迭香中[4]。香叶木苷具有抗炎、抗氧化和抗诱变的特性[5]。本研究通过建立异丙肾上腺素诱导心肌损伤模型，探索香叶木苷对异丙肾上腺素诱导的大鼠心脏功能紊乱和氧化应激的作用，以期为香叶木苷应用于心肌损伤的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选用45只SPF级健康成年雄性大鼠。鼠龄6～7个月，体质量150～200 g，饲养于新乡医学院实验动物中心。随机分为5组，分别为对照组(n=9)、异丙肾上腺素组(n=9)、香叶木苷低剂量组(n=9)、香叶木苷中剂量组(n=9)、香叶木苷高剂量组(n=9)。本研究通过我院医学伦理委员会批准。

1.2 主要仪器

Varioskan Flash 多功能酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；AMA440N 高压灭菌锅(英国Astell公司)；高速低温离心机(美国Beckman公司)；OLYMPUS DP71显微镜(日本奥林巴斯光学有限公司)；电泳槽，电转仪(美国Bio-Rad公司)；ABI StepOnePlus TM 荧光定量PCR仪(美国基因仪器公司)；凝胶成像系统GDS-800 UVP(美国UVP公司)。

1.3 药品与试剂

香叶木苷和异丙肾上腺素(美国Sigma公司)；Bax，Bcl-2，Caspase-3，Survivin，Nrf2，PGC-1α，TFAM，Ki67抗体(美国NEB公司)；HRP标记的山羊抗小鼠二抗(美国Santa Cruz公司)；蛋白Marker，Fermentas；EDTA 缓冲液(p H8.0)(武汉百耐特化工有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa(DRR037S))；SYBR©Premix Ex TaqTM(Tli RNase H Plus，TaKaRa(DRR420A))；ECL 发光试剂盒，RIPA强裂解液(碧云天)；PVDF膜(谷歌生物)；大鼠CK、CKMB、c TnI ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；大鼠SOD，MDA，LDH 试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 动物模型建立与药物干预

将异丙肾上腺素溶于生理盐水中，每隔24 h皮下注射(100 mg/kg·d)大鼠，诱导实验性心肌梗死[6]。香叶木苷低、中、高剂量组大鼠分别用5、10、20 mg/kg剂量的香叶木苷口服给药。每天给药1次。连续给药10周后处死小鼠，取心脏组织进行相关研究。

1.5 实验方法

1.5.1 心脏功能指标

每组大鼠治疗10周后，检测心率(HR)，记录心电图T 波变化，并通过BL-420F生物机能实验系统记录LVSP水平和LVEF水平。

1.5.2 ELISA 法测定外周血中心损标记物CK、CKMB、c TnI的含量

每组大鼠治疗10周后，取大鼠外周血，分离出血清。采用ELISA 法测定大鼠血清CK、CKMB、c TnI的含量。操作步骤严格按照大鼠CK、CKMB、c TnI ELISA 试剂盒说明书进行。

1.5.3 HE染色

每组大鼠治疗10周后，麻醉处死大鼠取部分心脏组织放入4%多聚甲醛溶液进行固定，24 h后脱水，石蜡包埋、切片；然后HE染色:将切片分别置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ，以及体积分数为100%、95%、90%、80%、70%的酒精各10 min，自来水冲洗；苏木精染色、伊红染色；由低到高浓度酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片；光学显微镜拍照，观察其形态特征。

1.5.4 免疫组化分析

采用链霉亲和素-生物素-复合过氧化物酶试剂盒对肿瘤组织中Ki67进行免疫组织化学染色。最后，将载玻片冲洗、脱水并安装在显微镜下检查和计数免疫反应细胞(黄色到棕色)。在与奥林巴斯显微镜相连接的Image-Pro Plus图像分析系统上对异种移植物的免疫染色进行分析。在400×放大倍数下，通过计算黄色到棕色细胞和5个随机选择的视野中的细胞总数来定量Ki67染色呈阳性的细胞。

1.5.5 试剂盒检测MDA、SOD、LDH 的含量

每组大鼠治疗10周后，麻醉处死大鼠，取心肌组织，提取心肌细胞上清。分别采用SOD、MDA、LDH 试剂盒测定心肌细胞上清液SOD、MDA、LDH、GSH 的含量。操作步骤严格按照大鼠SOD、MDA、LDH、GSH 试剂盒说明书进行。

1.5.6 免疫印迹法

使用裂解缓冲液(Beyotime，Shanghai，China)裂解细胞样品。然后，使用BCA 蛋白质测定试剂盒(Beyotime)定量蛋白质浓度。含有20 mg蛋白质的样品在体积分数为10%的SDS-PAGE 中分离，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用体积分数为5%的脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，随后加入一抗(Bax，1∶1 000；Bcl-2，1∶1 000；Caspase-3，1∶1 000；Survivin，1∶1 000；Nrf，1∶1 000；PGC-1α，1∶1 000；TFAM，1∶1 000于4 ℃封闭过夜，第2天加入对应二抗室温封闭1 h，最后滴加ECL，设置曝光参数，检测目的条带对应化学发光强弱。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，数据以表示。采用单因素方差分析，若方差齐则两组间比较用LSD 法，若方差不齐则两组间比较用Dunnett's法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 香叶木苷保护异丙肾上腺素诱导心肌损伤大鼠的心脏功能

如表1所示:与对照组比较，异丙肾上腺素组HR、LVSP和LVEF 均显著降低(P＜0.05)；与异丙肾上腺素组比较，香叶木苷中、高剂量组HR、LVSP和LVEF均显著升高(P＜0.05)。

表1 不同组心脏功能指标检测

2.2 香叶木苷降低血清中CK、CKMB、cTnI的含量

如表2所示:与对照组比较，异丙肾上腺素组大鼠血清中CK、CKMB、c TnI含量均显著升高(P＜0.05)；与异丙肾上腺素组比较，香叶木苷中、高剂量组大鼠血清中CK、CKMB、c TnI含量均显著降低(P＜0.05)。

表2 不同组血清中CK、CKMB、cTnI的含量

2.2 香叶木苷缓解异丙肾上腺素诱导的心肌损伤

如图1所示:对照组心肌细胞边缘清晰，核膜完整，心肌纤维排列整齐，无细胞间物质水肿；异丙肾上腺素组心肌细胞出现肿胀，明显的细胞间物质水肿，界限模糊，有少量交叉条纹；中、高剂量香叶木苷分别处理后，细胞间水肿减轻，心肌损伤介于异丙肾上腺素组和对照组之间。

图1 不同组大鼠心肌组织病理学变化

2.3 香叶木苷促进心肌细胞中Ki67的表达

如图2所示，对照组心肌细胞内可见大量棕黄色颗粒，与对照组比较，异丙肾上腺素组仅见少量棕黄色颗粒。依次用低、中、高剂量的香叶木苷处理后，心肌细胞内棕黄色颗粒依次增多。如图3所示，对照组、异丙肾上腺素组、香叶木苷低剂量组、香叶木苷中剂量组和香叶木苷高剂量组心肌细胞中Ki67阳性细胞分别为(58.45±5.21)%、(5.98±1.43)%、(9.12±2.41)%、(61.22±5.79)%。与对照组比较，异丙肾上腺素组心肌细胞中Ki67阳性细胞数显著降低(P＜0.05)；与异丙肾上腺素组比较，香叶木苷中、高剂量组心肌细胞中Ki67阳性细胞数显著升高(F=155.70，P＜0.05)。

图2 免疫组化检测Ki67的表达

2.4 香叶木苷促进Survivin的蛋白表达，抑制Bax/Bcl和Caspase-3的蛋白表达

从图4所示western-blot条带中可看出:与对照组比较，异丙肾上腺素组Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白表达量升高，Survivin蛋白表达量降低。香叶木苷中、高剂量组Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白表达量较异丙肾上腺素组降低；Survivin蛋白表达量较异丙肾上腺素组升高。western-blot灰度分析结果见表3:与对照组比较，异丙肾上腺素组Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白表达水平均显著升高(P＜0.05)，Survivin蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)；与异丙肾上腺素组比较，香叶木苷中、高剂量组Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05)，Survivin蛋白表达水平显著升高(P＜0.05)。

表3 不同组Bax/Bcl、Caspase-3和Survivin蛋白表达水平的western-blot灰度分析结果

图4 不同组Bax/Bcl、Caspase-3和Survivin蛋白表达水平

2.5 香叶木苷对SOD、LDH活性及MDA含量的影响

如表4所示:与对照组比较，异丙肾上腺素组SOD活性显著降低(P＜0.05)，MDA含量及LDH 活力均显著升高(P＜0.05)；与异丙肾上腺素组比较，香叶木苷中、高剂量组SOD 活性显著升高(P＜0.05)，MDA 含量及LDH 活力均显著降低(P＜0.05)。

表4 不同组SOD、MDA和LDH的含量

2.6 香叶木苷促进PGC-1α，TFAM 蛋白表达和Nrf2的活性

如图5所示:从western-blot条带中可以看出，各组Nrf2总蛋白相对表达水平比较无统计学意义(P＞0.05)。异丙肾上腺素组p-Nrf2、PGC-1α，TFAM 蛋白表达量较对照组降低。与异丙肾上腺素组比较，香叶木苷中、高剂量组p-Nrf2、PGC-1α，TFAM 蛋白表达量明显升高。Western-blot灰度分析结果见表5，与对照组比较，异丙肾上腺素组p-Nrf2，PGC-1α，TFAM 蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05)。与异丙肾上腺素组比较，香叶木苷中、高剂量组p-Nrf2，PGC-1α，TFAM 蛋白表达水平均显著升高(P＜0.05)。

表5 不同组大鼠心肌组织Nrf2、PGC-1a和TFAM 蛋白表达水平

图5 不同组Nrf2、PGC-1a和TFAM 蛋白表达水平

3 讨论

心肌损伤可引起心脏血流动力学参数的改变，从而影响心脏功能。HR 以及LVSP、LVEF 水平均为心脏功能的指标。研究[7]发现，心肌缺血/再灌注损伤能引起HR 和LVDP明显降低，心脏功能受到破坏。Song[8]等报道称miR-320治疗后LVEF，LVFS，LVSP明显升高，可改善心脏功能，缓解缺血再灌注损伤。与前人研究结果相似，本研究发现香叶木苷治疗后，HR、LVSP、LVEF 水平均升高，表明香叶木苷对心脏功能具有保护作用。

c TnI和CK、CKMB三种心肌损伤标志物在心肌损伤诊断发挥着重要作用。异丙肾上腺素诱导的心肌梗死大鼠血清中CKMb含量的升高证实造成了心肌损伤。研究[4]发现香叶木苷通过降低CK、CKMB含量可阻断过量异丙肾上腺素的毒性作用，抑制心脏损伤。同样，Abdel-Daim[9]等通过HE 染色发现香叶木苷能明显减轻心肌组织病理学损伤，在香叶木苷处理后，血清中CKMB 的浓度显著降低。c Tn T 作为可收缩蛋白，是诊断人类和动物心肌梗死模型的高度特异性和敏感性的标志物，研究[10]发现，香叶木苷可降低异丙肾上腺素诱导的心肌梗死大鼠血清c TnI的水平，这可能是由于香叶木苷秦楚自由基的作用使心肌损伤程度下降所致。本研究发现香叶木苷治疗降低了大鼠血清中CK、CKMB、c TnI的含量，表明香叶木苷对心肌具有保护作用。

通过抑制细胞凋亡和促进细胞生长对氧化应激相关性心血管疾病的发挥着重要作用。Ki67为增殖细胞中核抗原，表达量与细胞分裂密切相关，而Survivin是凋亡抑制因子家族中一个独特的成员，在细胞周期调控、凋亡过程中起着重要作用，研究发现香叶木苷通过降低Bax和Caspase-3的表达，对三氯乙烯诱导的肾损伤具有保护作用[11]。LIU[12]等研究发现高剂量的香叶木苷能显著上调Bcl的表达，下调Bax的表达，对缺血再灌注损伤具有有效的抗凋亡作用。本研究发现香叶木苷处理后，心肌细胞中Ki67阳性细胞数升高。香叶木苷促进Survivin的蛋白表达，抑制Bax/Bcl和Caspase-3的蛋白表达，表明香叶木苷促进心肌细胞生长，可能通过调节内源性凋亡途径，从而抑制细胞凋亡。

氧化应激是心肌损伤的主要病理因素。Nrf2是细胞内重要的保护性转录调节因子，可调节众多与缓解细胞氧化应激相关的基因表达，对于抵抗氧化应激有重要的调节作用[13]。PGC-1α是线粒体重要的转录调节因子，可以与其他转录因子结合进而调控线粒体抗氧化状态。PGC-1α与Nrf2 共激活可以调节TFAM 的表达，进而调节线粒体DNA 转录和复制。目前尚无香叶木苷对氧化应激相关蛋白Nrf2，PGC-1α，TFAM 影响的相关研究，而本研究发现香叶木苷治疗后，激活Nrf2通路，氧化应激相关蛋白PGC-1α和TFAM 表达水平升高，表明香叶木苷具有线粒体抗氧化的作用，具体作用机制有待进一步研究。Abdel-Daim[9]等报道称香叶木苷能够降低MDA 的浓度，增加SOD 的活性，从而发挥抗氧化作用。研究[14]发现香叶木苷治疗后，SOD的活性增加，LDH 活力降低，从而减轻氧化损伤。本研究发现香叶木苷治疗后，SOD 活性升高，MDA含量以及LDH 活力降低，表明香叶木苷具有抗氧化作用。

综上所述，本研究通过建立异丙肾上腺素诱导心肌损伤模型，香叶木苷可能通过直接或间接途径激活Nrf2通路，促进心肌细胞生长，抑制其凋亡，缓解异丙肾上腺素诱导的大鼠心脏功能紊乱和氧化应激，表明香叶木苷对异丙肾上腺素诱导的心肌损伤具有缓解作用，为香叶木苷应用于临床治疗心肌损伤提供实验依据。