miR-122-5p对类风湿关节炎滑膜细胞增殖与凋亡的影响及其机制

郭占非,吴洁,杨学华,许振丹,范文强,高晓

(1 新乡市中心医院(新乡医学院第四临床学院)风湿免疫科,河南 新乡 453000； 2 新乡市第二人民医院肾病风湿科)

类风湿关节炎(RA)是一种影响多个关节的全身自身免疫性疾病，其可导致关节中滑膜细胞的增殖，而血管翳的形成可能导致潜在的软骨破坏和骨侵蚀，以及促炎细胞因子的过量产生，加快破坏进程的发展[1-2]。RA的发病原因与其他自身免疫性疾病一样，病因复杂多样。临床上的药物以抑制免疫反应、减轻炎症为主，不能达到根治的目的，而且长期使用对机体产生的副作用较大[3-4]。因此，提高RA的治疗效果成为该领域的一大难题。miRNA是由长度为20个左右的核苷酸组成的短链内源性非编码的微小RAN分子，在机体各种疾病的发生中具有举足轻重的作用[5]。据报道，miRNA在RA中也具有调控作用[6]，其中包括miR-122-5p[7]。盘状结构域受体激酶(DDR2)属于受体激酶酪氨酸的一种，大量研究显示，其在RA中具有重要的促炎作用[8]。本研究拟以RA病人滑膜细胞为研究对象，检测miR-122-5p和DDR2在滑膜细胞的表达，并观察调控 miR-122-5p和DDR2表达对该细胞增殖、凋亡的影响，揭示miR-122-5p与DDR2的靶向关系，旨在为RA的治疗提供新的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本文所用组织标本，均来自新乡市中心医院接受手术治疗的8例RA病人及意外交通事故导致关节粉碎性骨折的5例病人。DMEM培养液、胰蛋白酶购自GIBCO公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；甲基噻唑基四唑(MTT)试剂购自美国Sellect公司；LipofectamineTM2000、逆转录试剂盒购自大连Takara公司；Trizol液购自北京百奥莱博；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)试剂盒、增强型化学发光试剂(ECL)发光液和放射免疫沉淀试验(RIPA)蛋白裂解液等均购自碧云天生物技术公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞的分离、培养及分组处理 按照梁晓辉等[9]报道的方法，取新鲜滑膜组织剪碎，用DMEM培养液和胰蛋白酶消化后进行分离培养RA滑膜细胞和正常滑膜细胞。将miR-122-5p寡核苷酸模拟物(miR-122-5p mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、miR-122-5p特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-122-5p)及其阴性对照(anti-miR-NC)、miR-122-5p mimics+空载体(pcDNA)、miR-122-5p mimics+DDR2过表达载体(pcDNA-DDR2)用脂质体LipofectamineTM2000转染至RA滑膜细胞。转染6 h后，更换培养液继续培养48 h，分别标记为miR-NC组(A组)、miR-122-5p组(B组)、anti-miR-NC组(C组)、anti-miR-122-5p组(D组)、miR-122-5p+pcDNA组(E组)和miR-122-5p+pcDNA-DDR2组(F组)用于后续实验。

1.2.2实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测细胞中miR-122-5p和DDR2的表达 Trizol法提取细胞样本总RNA,并用Nano-Drop 2000微量分光光度计进行RNA定量。DNase Ⅰ 消化RNA中可能污染的DNA。采用逆转录试剂盒合成模板链cDNA。按扩增反应体系进行PCR，每个样品重复3次，取平均值，反应结束后分析Ct值，以2-△△Ct法计算miR-122-5p和DDR2的相对表达水平。

1.2.3Western blot法检测细胞中DDR2、P21和Survival的蛋白表达 收集细胞，加入裂解液，冰上裂解20～30 min。以12 000 r/min离心10 min，取上清置于EP管，加入5×SDS上样缓冲液，沸水煮沸10 min。电泳后将蛋白转移至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉将膜封闭2 h；洗膜，加入一抗，4 ℃过夜孵育；洗膜，加二抗，4 ℃孵育2 h。加发光液，曝光。以GAPDH为内参照，以目的条带与GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达。

1.2.4MTT实验检测细胞增殖 调整细胞密度至107/L，然后接种至96孔板中，取适量的细胞(每孔1 000个)，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，孵育4 h。终止细胞培养，弃去培养液上清，然后每孔加入150 μL的DMSO，振荡使结晶充分融解，在490 nm波长处检测细胞吸光度(OD490)。细胞增殖能力与细胞的吸光度值呈正比。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡 按照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书步骤进行操作，用500 μL的结合缓冲液悬浮细胞，首先加入5 μL的Annexin V-FITC避光反应20 min，然后再加入5 μL的PI避光反应20 min，最后在1 h内上流式细胞仪结束检测。细胞凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.6双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞miR-122-5p与DDR2的结合力 将荧光素酶报告载体(psiCHECK2-DDR2-WT,psiCHECK2-DDR2-MUT)分别加入用脂质体法转染miR-122-5p mi-mics和miR-NC的 RA滑膜细胞，培养6 h后，更换新鲜培养液继续培养，转染48 h。按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行操作。结果以海肾荧光素酶的发光强度与萤火虫荧光素酶发光强度的比值表示miR-122-5p与DDR2的结合力。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 miR-122-5p和DDR2在RA滑膜细胞表达

qRT-PCR和Western blot检测结果显示，与正常滑膜细胞组相比较，RA滑膜细胞组细胞中miR-122-5p表达显著降低，DDR2 的mRNA和蛋白表达均显著升高(t=27.714～48.853,P<0.001)。见图1和表1。

2.2 过表达miR-122-5p对RA滑膜细胞增殖和凋亡的影响

MTT法和流式细胞术检测细胞增殖与凋亡结果显示，不同时间、不同组别及其二者交互作用下OD490比较，差异均有统计学意义(P<0.001)。与miR-NC组相比较，miR-122-5p组RA滑膜细胞中miR-122-5p表达显著升高，48、72 h时细胞增殖显著降低、细胞凋亡率显著升高，P21和Survival蛋白表达均显著降低(t=16.716～121.500，P<0.001)。见图2和表2。

A：正常滑膜细胞；B：RA滑膜细胞。

表1 两组滑膜细胞miR-122-5p和DDR2表达的比较

A：miR-NC组；B：miR-122-5p组。

表2 过表达miR-122-5p对RA滑膜细胞增殖和凋亡影响

2.3 miR-122-5p与DDR2的结合力检测

miR-122-5p靶向DDR2的生物信息学预测显示，DDR2与miR-122-5p的5′端存在8个互补的核苷酸序列(见图3)。双荧光素酶报告基因检测实验结果显示，与miR-NC组相比，miR-122-5p组WT-DDR2细胞的荧光活性显著降低(t=100.623，P<0.001)，MUT-DDR2细胞的荧光活性无显著变化。见表3。与anti-miR-NC组(1.00±0.01)相比，anti-miR-122-5p组(1.89±0.13)细胞中DDR2蛋白表达显著升高，与miR-NC组(1.01±0.01)相比，miR-122-5p组(0.21±0.02)细胞中DDR2蛋白表达显著降低(F=969.103，P<0.001)。见图4。

2.4 DDR2过表达对miR-122-5p调控RA滑膜细胞增殖和凋亡的影响

不同时间、不同组别及二者交互作用下OD490比较，差异有统计学意义(P<0.001)。与miR-122-5p+pcDNA组相比，miR-122-5p+pcDNA-DDR2组细胞中DDR2蛋白表达显著升高，48、72 h时细胞增殖显著升高、细胞凋亡率显著降低，P21和Survival蛋白表达均显著升高(t=106.335～327.990，P<0.001)。见表4和图5。

表3 双荧光素酶报告基因检测实验结果

表4 DDR2过表达对miR-122-5p调控RA滑膜细胞增殖和凋亡的影响

图3 miR-122-5p与DDR2的结合位点

A：miR-NC组，B：miR-122-5p组，C：anti-miR-NC组，D：anti-miR-122-5p组。

B：miR-122-5p组，E：miR-122-5p+pcDNA组，F：miR-122-5p+pcDNA-DDR2组。

3 讨 论

miRNA在包括RA的多种疾病中具有重要的作用[10]。如miR-146a、miR-203和miR-223等在关节炎中均发挥重要的调控作用[11-13]。WANG等[14]使用miRNA阵列技术筛选RA病人血浆中的差异miRNA，发现miR-122-3p的表达水平明显降低。张莹莹等[15]研究也发现，miR-122-3p在RA病人血浆中异常降低。研究显示，ANRIL可以通过miR-122-5p/DUSP4轴调节骨关节炎滑膜细胞的增殖和凋亡[16-22]。但关于miR-122-5p在RA中的作用及其对滑膜细胞的影响尚未见报道。本研究检测了RA病人滑膜细胞中miR-122-5p的表达，研究结果显示，miR-122-5p低表达。进一步过表达miR-122-5p后的结果显示，RA滑膜细胞活性降低，细胞凋亡率显著升高，P21和Survival蛋白表达均显著降低，说明过表达miR-122-5p可抑制RA滑膜细胞增殖、促进其凋亡。这为RA病人滑膜病变机制提供了基础，也为miRNA在RA中的诊断和治疗研究及应用提供参考依据。

DDR2为酪氨酸激酶受体家族成员之一，其在RA滑膜组织中的表达异常升高，对软骨细胞具有破坏作用[23]。抑制DDR-2可降低关节炎模型小鼠炎症反应和关节破坏严重程度[24-27]。此外，研究发现DDR2-CYR61-MMP1信号通路通过调节滑膜细胞的迁移和侵袭，促进RA的骨侵蚀[28]。本文研究结果也显示，RA滑膜细胞中DDR2高表达，与文献报道结果相一致[23]，这为探索DDR2在RA中的功能提供了体外研究的理论依据。本实验结果还表明，miR-122-5p靶向负调控DDR2的表达，以及过表达DDR2可抑制miR-122-5p对RA滑膜细胞的增殖抑制和凋亡促进作用，这说明不仅miR-122-5p可靶向调控DDR2的表达，而且DDR2也可逆向调控miR-122-5p的表达，从而发挥对RA的调控功能。这为miR-122-5p在RA治疗中的潜在价值开发提供了更充分的理论依据。

综上所述，miR-122-5p可抑制RA滑膜细胞增殖、促进其凋亡，其机制可能与miR-122-5p靶向调控DDR2有关，本研究结果为RA治疗提供了新的方向。但miR-122-5p上游基因是如何调控其表达及其在RA发生发展过程中的作用机制尚未明确。