脑蛋白水解物-Ⅰ对PD小鼠的神经保护作用及机制

王悦,武筱林,任宇倩,马晓晴，刘英娟

(青岛大学医学部中西医结合中心,山东 青岛 266021)

帕金森病(PD)是全球第二大神经退行性疾病，其病理特征是纹状体中多巴胺含量降低及黑质中多巴胺能神经元变性，以肌强直、震颤、运动迟缓和步态姿势异常等运动特征为主要临床表现[1-3]。目前，临床上PD的治疗仍以补充外源性多巴胺类药物和抑制乙酰胆碱能类药物为主，但远期疗效不十分理想。脑蛋白水解物-Ⅰ(CH-Ⅰ)是通过动物脑组织蛋白酶水解而获得的多种氨基酸和低分子肽的混合物，其50%～80%的游离氨基酸可通过血-脑脊液屏障进入脑神经细胞，分子量低于10 000的小分子肽也可透过血-脑脊液屏障并影响呼吸链[4]。研究表明，脑蛋白水解物具有抗低氧作用，可改善脑细胞低氧症状，增强脑对低氧的耐受性；此外，CH-Ⅰ尚能促进神经细胞的蛋白质合成，使已损伤但未变性的神经细胞恢复功能[5]。SUI等[6]的研究表明，脑蛋白水解物注射液可以通过下调半胱天冬酶分子表达减轻脑缺血再灌注损伤。有文献报道，CH-Ⅰ对血管性痴呆等神经系统疾病具有较好的疗效[7]。但CH-Ⅰ对PD的疗效尚未见报道。因此，本研究用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导建立PD小鼠模型，并用CH-Ⅰ进行干预，探讨CH-Ⅰ对PD小鼠的神经保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

CH-Ⅰ注射液(#0190501-1，每支30 mg)为河北智同生物制药股份有限公司产品；MPTP、甲苯胺蓝购自Sigma-Aldrich公司(St. Louis，MO，USA)；单克隆抗体酪氨酸羟化酶(TH，#ab112)、神经生长因子(NGF，#ab52918)、脑源性神经营养因子(BDNF，#ab108319)、GAPDH(#ab8245)购自Abcam公司(Cambridge，USA)。成年健康雄性C57BL/6小鼠48只，8～10周龄，体质量为25～30 g，由南京模式动物研究中心提供。

1.2 动物分组及处理

小鼠饲养于温度(23±2)℃、湿度60%～70%的环境中，给予12 h/12 h昼夜循环光照，可自由进食。小鼠预适应环境7 d后，采用随机数字法分为对照组(A组)、模型组(B组)、CH-Ⅰ 10 mg/kg组(C组)和CH-Ⅰ 20 mg/kg组(D组)，每组12只。除对照组小鼠腹腔注射生理盐水外，其余3组小鼠每天给予30 mg/kg的MPTP腹腔注射，连续7 d，诱导建立PD小鼠模型。通过爬杆实验和悬挂实验判定造模是否成功。然后，CH-Ⅰ 10 mg/kg组以及CH-Ⅰ 20 mg/kg组小鼠连续14 d给予对应剂量的CH-Ⅰ腹腔注射，对照组及模型组小鼠注射等体积生理盐水。动物的处理遵循青岛大学附属医院实验动物伦理委员会制定的实验动物福利原则。

1.3 行为学评价

全部小鼠给药结束后，进行行为学评价。参考CAO等[8]报道的方法进行悬挂实验。取一条棉线质长绳，固定在离地面高约50 cm处，被测小鼠倒置悬挂，使小鼠前爪抓住绳子，观察小鼠的行为：若小鼠用两后爪抓绳，记为3分；单后爪抓绳，记为2分；后爪不抓绳，记为1分；掉落则记为0分。

1.4 免疫印迹法(Western blot)检测蛋白表达

行为学实验结束以后，每组取6只小鼠，应用100 mg/L水合氯醛腹腔注射深度麻醉，于冰上迅速开颅完整取脑，取出纹状体，置-80 ℃保存。组织称质量后，按50 mL/g加入裂解液(50 mmol/L Tris、pH值7.4，150 mmol/L NaCl，10 g/L Triton X-100，10 g/L脱氧胆酸钠，1 g/L SDS，原钒酸钠，氟化钠，EDTA以及亮肽素)，4 ℃匀浆研磨后，以12 000 r/min离心5 min，收集上清液。采用BCA试剂盒测定蛋白含量。加入上样缓冲液(主要成分为SDS、DTT、溴酚蓝、缓冲盐溶液等)混匀，于100 ℃水浴中变性5 min，在100～150 g/L SDS-PAGE凝胶中进行垂直电泳，湿转法将蛋白转至PVDF膜上。用50 g/L牛血清清蛋白作为封闭液，孵育2 h。然后加入兔抗TH(1∶1 000)、兔抗NGF(1∶1 000)、兔抗BDNF(1∶1 000)和兔抗GAPDH(1∶5 000)等一抗4 ℃过夜孵育，用TBST洗3次，每次10 min，再加入HRP-IgG二抗(1∶2 000)孵育。ECL显影，将所有胶片进行扫描，分析各条带的光密度值。计算其他3组相对于对照组的目的蛋白表达量。

1.5 Nissl 染色观察细胞损伤程度

采用Nissl染色法评估神经元细胞死亡的程度[9-10]。行为学实验结束后，每组取6只小鼠，用100 g/L水合氯醛腹腔注射深度麻醉，以预冷生理盐水20 mL灌流后，应用40 g/L多聚甲醛灌注，至小鼠四肢变白、肝脏变硬。随后取出小鼠整脑，在40 g/L多聚甲醛中固定24 h。常规脱水、透明、浸蜡、包埋，自视交叉后连续冠状切片，每隔3张抽取1张，贴于经多聚赖氨酸处理的载玻片上。石蜡切片经脱蜡和水化后，加入10 g/L甲苯胺蓝溶液，60 ℃孵育40 min。切片用蒸馏水洗涤3次，每次10 min，进行乙醇分级脱水处理后，中性树脂封片。光学显微镜下观察细胞形态及细胞损伤程度。计算其他3组相对于对照组的染色细胞数。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 CH-Ⅰ对PD小鼠行为学障碍的影响

模型组小鼠的机体协调性较对照组明显减弱，经CH-Ⅰ处理以后，CH-Ⅰ 10 mg/kg组和CH-Ⅰ 20 mg/kg组小鼠的肌肉力量得到恢复，机体协调性较模型组明显改善(F=5.516，P<0.05)。而CH-Ⅰ 10 mg/kg组和CH-Ⅰ 20 mg/kg组行为学评分比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。

2.2 CH-Ⅰ对PD小鼠神经营养因子表达的影响

模型组小鼠纹状体神经细胞内NGF和BDNF的表达均较对照组明显降低，经CH-Ⅰ处理后，CH-Ⅰ 10 mg/kg组和CH-Ⅰ 20 mg/kg组小鼠纹状体神经细胞内NGF和BDNF的表达较模型组明显增加(F=44.110、26.567，P<0.01)。见图1和表1。

2.3 CH-Ⅰ对PD小鼠TH表达的影响

模型组小鼠纹状体神经细胞内TH的表达较对照组明显降低，经CH-Ⅰ处理后，CH-Ⅰ 10 mg/kg组和CH-Ⅰ 20 mg/kg组TH的表达较模型组明显增加，特别是CH-Ⅰ 20 mg/kg组TH的表达增加尤为明显(F=43.458，P<0.01)。提示CH-Ⅰ可以通过提高TH的表达而抑制PD进展。见图2和表1。

2.4 CH-Ⅰ对PD小鼠神经细胞损伤程度的影响

纹状体神经元Nissl染色定量分析显示，模型组Nissl染色细胞数较对照组明显减少，经过CH-Ⅰ处理后，CH-Ⅰ 10 mg/kg组和CH-Ⅰ20 mg/kg组Nissl染色细胞数均较模型组明显增加(F=121.066，P<0.01)。提示MPTP诱导了小鼠的神经元丢失，而CH-Ⅰ可以抑制MPTP诱导的神经元丢失。见图3和表1。

A：对照组；B：模型组；C：CH-Ⅰ 10 mg/kg组；D：CH-Ⅰ 20 mg/kg组。

A：对照组；B：模型组；C：CH-Ⅰ 10 mg/kg组；D：CH-Ⅰ 20 mg/kg组。

A：对照组；B：模型组；C：CH-Ⅰ 10 mg/kg组；D：CH-Ⅰ 20 mg/kg组。Nissl染色，200倍。

表1 各组小鼠不同观察指标的比较

3 讨 论

PD是一种以纹状体中多巴胺含量降低及黑质中多巴胺能神经元变性为主要病理特征的神经退行性疾病，多发生于50岁及以上中老年人，给社会和经济都带来严重影响。PD的发病机制尚不明确，药物治疗是目前临床治疗PD的主要方法，但多为对症治疗及经验性治疗，可延缓病人病情发展、毒副作用少、疗效长久的药物比较缺乏，难以抑制和扭转病人的神经功能退行性病变。CH-Ⅰ是一种通过酶解动物脑蛋白获得的低分子肽混合物，对多种神经系统疾病，如卒中、血管性痴呆和急性脑梗死等，均具有显著的治疗效果，但它对PD影响的报道很少。有研究表明，CH-Ⅰ可加速葡萄糖通过血-脑脊液屏障的运转速度，改善脑能量供应，增加腺苷酸环化酶的活性，催化其他激素系统，改善记忆功能[6,11]。本研究结果显示，经CH-Ⅰ干预后，MPTP诱导的PD小鼠的机体协调性得到明显改善，提示CH-Ⅰ可能通过上述机制改善PD小鼠的神经行为功能。

NGF是一种具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的神经细胞生长调节因子，对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的维持均具有重要的调控作用[12]。BDNF是一种在大脑中合成的蛋白质，在中枢神经系统发育过程中对神经元的生存、分化、生长和发育起重要作用[13]。TH是多巴胺合成的限速酶，常被用作检测多巴胺能神经元完整性的标志酶[14-15]。本研究应用免疫印迹法检测显示，CH-Ⅰ可以显著增加NGF、BDNF以及TH的表达水平，提示CH-Ⅰ可以通过提高PD小鼠神经营养因子和TH的表达而抑制PD的病情进展。

神经元是神经系统的结构和功能单位，尼氏小体(Nissl body)是神经元的特征结构之一，其主要功能是合成神经活动所需要的蛋白质，如细胞某些组件更新和神经递质相关的蛋白质和酶的生成[11]。本研究Nissl染色结果表明，CH-Ⅰ对MPTP诱导的PD小鼠具有较好的神经保护作用，可以抑制MPTP诱导的神经元丢失。观察是否具有类似PD症状的小鼠行为学实验，常被用作初步评价PD小鼠病情程度或药物疗效的方法。本研究采用悬挂实验评估结果也显示，CH-Ⅰ可以显著改善PD小鼠的行为障碍。

总之，CH-Ⅰ可以能通过增加NGF、BDNF以及TH的表达水平，抑制MPTP诱导的小鼠神经细胞损伤，从而改善PD小鼠的行为学障碍，发挥神经保护作用。