转BpTCP10基因抑制表达白桦的耐盐性分析

李芳蕊，许思佳，刘霁广，向泓霖，张家伟，崔帅，丁一淇，李慧玉

（东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

转录因子（Transcription Factor）又称反式作用因子，能够在植物细胞代谢、器官构成及环境应答等多种生物学过程中发挥重要作用。目前，已经发现了众多植物转录因子家族，主要有NAC、WRKY、MYB、AP2/EREBP、bHLH等[1]。随着研究的不断深入，bHLH 家族转录因子的更多功能也逐步被发现。TCP家族基因属于bHLH转录因子的一类，也是植物特有的转录因子，具有保守的螺旋-环-螺旋蛋白质结构，广泛参与到植物的细胞增殖分化、器官形态建成、光形态建成及衰老等生物学过程[2-12]。TCP家族成员均含有一个由59 个氨基酸残基组成的保守结构域，且根据保守结构域的差别，TCP家族基因分为Class I（PCF 类）和Class II（CIN 和CYC/TB1）两类[13]。Class I类基因功能在草本植物中研究得较为深入，在拟南芥Arabidopsis thaliana中，Class I 亚类的AtTCP14和AtTCP15基因共同参与了叶形和节间发育的调控，AtTCP20参与调控细胞的增大、分裂以及分化，同时AtTCP21是植物生物钟的重要组成部分[14]。MicroRNAs 是广泛存在于生物界的非编码单链RNA，通过调节其靶基因的表达量来改变植物的生长发育进程。在杨树中，PtmiR393靶向调控杨树FBL家族基因，影响植物体的生命活动[15]。MicroRNA319（miR319）已被证明能够靶向调控TCP基因。在葡茎剪股颖Agrostis stolonifem中，miR319a过表达植株中靶基因AsPCF5/6/8/14下调表达，转基因株系表现出抗旱和耐盐性增强[16]。水稻Oryza sativa中，OsPCF2通过启动OsNHX1的表达来响应盐和PEG 胁迫[17]。OsPCF6和OsTCP21通过清除活性氧(ROS)，提高了水稻的耐寒性[18]。OsTCP19与ABA 信号通路基因OsABI4和OsULT1相互作用，参与植物非生物胁迫响应[19]。在茶树Camellia sinensis中，CsTCP转录因子在茶树生长发育及激素信号转导过程中发挥作用，推测其可能通过激素信号转导途径参与调节植物生长[20]。在香鳞毛蕨Dryopteris fragrans中的研究也得出了类似结论[21]。

白桦Betula platyphylla是在东北地区广泛分布的用材树种，但耐盐能力低，而东北地区未来的造林地多为干旱半干旱、且盐渍化程度较高的地区。白桦也是我国北方主要城市绿化树种，但融雪剂引起的土壤盐渍，严重影响了白桦的生长及绿化效果。TCP家族基因产物间常形成同源或异源二聚体。酵母双杂交结果表明，BpTCP10 蛋白可分别与多个TCP家族的其他成员（BpTCP1、BpTCP2、BpTCP4、BpTCP7、BpTCP9、BpTCP11）的蛋白发生相互作用[22]，形成二聚体，故而推测BpTCP10基因是揭示TCP家族基因功能的核心。本研究以白桦为试材，在克隆TCP家族基因PCF 亚类中的BpTCP10基因的基础上，研究该基因的表达特性；同时构建植物抑制表达载体，进行白桦遗传转化，对转基因白桦株系进行耐盐性分析。探讨该基因在白桦生长发育及耐盐方面的功能，为培育耐盐白桦良种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料与胁迫处理

选取东北林业大学林木遗传育种试验基地的10年生已开花结实的野生型欧洲白桦植株，5—9月间，每隔15 天取白桦雄花序、叶片、嫩茎、顶芽的材料一次。因雄花序越冬宿存，次年继续发育，而雌花序次年4月发育，当年成熟。故于次年4月，每隔5 天摘取雄花序和雌花序，用于提取RNA，进行BpTCP10基因组织部位表达特性分析。

对从白桦育种基地采集的全同胞家系种子进行水培，待长出两片子叶后，选取大小一致的幼苗分别平铺在涂有相应激素和非生物胁迫处理试剂的WPM 培养基中，培养基中分别加入1 μmol/L ME-JA、0.1 mol/L ABA、20% PEG600、0.4 mol/L NaCl、0.15 mol/L CdCl2、0.3 mol/L NaHCO3[22]。分别在处理0、2、4、6、12、24 h 进行取材。每种激素与非生物胁迫试剂均处理幼苗120 株，每个时间点收集20 株，经液氮速冻，放入-80℃冰箱存放，用于提取RNA，研究BpTCP10基因对于激素及非生物胁迫的应答分析。

BpTCP10基因抑制表达白桦株系及对照株系生根移栽后2 个月，各株系内分别选取长势一致、无病虫害的植株各10 株，取第4～7 片成熟叶，采用植物叶盘打孔器法[23-24]。打孔取直径为10 mm 的叶盘。通过预试验确定对离体叶片进行NaCl 胁迫的最适浓度。将叶盘置于含有最适NaCl浓度的WPM 液体培养基中，每个培养皿放置15片，于组织培养室中进行培养，并于0、12 及24 h取材进行染色及生理指标测定。每个处理进行3次重复试验。

1.2 BpTCP10 基因的克隆及序列分析

根据白桦转录组序列，设计BpTCP10基因的ORF 序列特异引物（表1），以白桦叶片cDNA为模板，扩增BpTCP10基因的ORF 序列，并通过Gateway 技术构建到入门载体pENTR 上，通过PCR 及测序确定基因序列的准确性。

利用NCBI 上的在线寻找程序（ORF Finder）确定本序列的ORF；对蛋白质的分子量和理论等电点进行在线计算（http://web.expasy.org/protparam/）；用Blastx 进行同源序列比对，搜索拟南芥A.thaliana、水稻O.sativa、玉米Z.mays及毛果杨P.trichocarpa中的TCP基因家族PCF亚类同源基因的氨基酸序列，并利用Clustal W进行多序列比对，分析bHLH 结构域；使用上述基因的蛋白全长序列，借助MEGA 5.1 软件的Neighbor-Joining 算法，1 000 次重复，以默认参数构建系统发育进化树。从欧洲白桦基因组网站（https://genomevolution.org/CoGe/GenomeInfo.pl?gid=35080）中获得BpTCP10启动子序列，使用PLACE 数据库进行元件预测和分析。

1.3 qPCR 分析

使用RNA 提取试剂盒（Biotec，北京）提取白桦不同组织部位、激素及胁迫处理后（见1.1 植物材料与胁迫处理部分）幼苗及生根移栽两个月后，BpTCP10抑制表达转基因株系叶片的总RNA。采用ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（Toyobo）进行反转录，获得cDNA 后稀释10 倍作为模板，采用SYBR® Premix ExTaqTM Ⅱ（TAKARA） 试剂盒进行qPCR。BpTCP10基因引物序列参见表1。选用18sRNA 作为内参基因（上下游引物分 别 为5′-ATCTTGGGTTGGGCAGATCG-3′，5-CATTACTCCGATCCCGAAGG-3′），反应程序为：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸34 s（40 个循环），绘制溶解曲线的温度为95℃持续15 s，60℃持续1 min，95℃持续15 s。qPCR 在ABI PRISM® 7500 荧光定量PCR 仪上完成，所有样品均进行3 次重复，采用-ΔΔCt 方法进行基因的相对定量分析。

1.4 BpTCP10 基因植物抑制表达载体构建和白桦遗传转化

通过PCR 将BpTCP10基因的C 末端附加一段EAR 序列的抑制结构域（引物序列参见表1），使用双酶切技术将BpTCP10-SRDX 构建到以CAMV 35S 为启动子的pCAMBIA1300 载体上，通过PCR 及测序确定基因序列的正确性。构建好的pCAMBIA1300-BpTCP10-SRDX 载体通过电击转入农杆菌EHA105 中，采用农杆菌介导法进行白桦遗传转化[25]。获得的抗性植株通过PCR及qPCR 分析外源基因是否整合及其表达情况。转pCAMBIA1300 空载体的植株目的基因表达量与野生型并无显著差异[25]，故本研究采用野生型作为对照。

表1 白桦BpTCP10 克隆、抑制表达载体构建及定量PCR 引物序列Table 1 PCR primers used of Betula platyphylla BpTCP 10

1.5 DAB，NBT 染色及SOD，H2O2 的测定

采用南京建成生物工程研究所生产的超氧化物歧化酶及过氧化氢试剂盒分别测定SOD，H2O2。参考宁坤等[27]方法进行DAB 及NBT 染色。分别以0 h 时野生型株系的指标作为对照，材料、处理参数、时间及取材见1.1 植物材料与胁迫处理部分。每个指标均设置3 次生物学重复。

2 结果与分析

2.1 BpTCP10 基因克隆及生物信息学分析

根据白桦转录组数据中BpTCP10基因序列信息设计特异引物，以白桦叶片总RNA 为模板，克隆获得白桦BpTCP10基因的ORF 序列。生物信息学分析表明，BpTCP10基因的ORF 长度为813 bp，编码270 个氨基酸，相对分子质量为27 893.06 D，理论等电点为9.51。分别对属于TCP 基因家族PCF 亚类的2 条拟南芥、1 条毛果杨及BpTCP10基因，以及CIN 亚类的1 条拟南芥基因和1 条毛果杨基因的保守结构域部分的氨基酸序列进行分析，结果显示：BpTCP10基因与其他物种PCF 亚类基因的氨基酸序列均含有TCP保守结构域bHLH，不含有CIN 亚类的特有4 个氨基酸残基[28]，也没有R 结构域和谷氨酸-半胱氨酸-谷氨酸结构域（图1）。

图1 白桦BpTCP10 与其他物种TCP 基因bHLH 结构域的氨基酸序列比对Fig.1 Amino acid sequences alignment between Betula platyphylla BpTCP10 and the bHLH domain of other species

利用MEGA5.1，选取拟南芥、水稻、玉米及毛果杨的PCF 亚类基因的氨基酸序列与白桦BpTCP10氨基酸序列进行聚类分析，结果如图2所示，BpTCP10属于PCF 亚类，与拟南芥AtTCP11基因具有一定的相似性。

图2 白桦BpTCP10 与其他物种PCF 亚类基因的进化关系分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of BpTCP10 and other PCF subclass genes

使用PLACE 数据库进行元件预测和分析，结果表明，BpTCP10启动子中包含有多个激素响应及胁迫响应元件（表2）。激素响应元件包括：赤霉素响应相关元件（GARE1OSREP1，P-box，WRKY71OS）、生长素响应元件（CATATGGMSAUR，NTBBF1ARROLB）、茉莉酸甲酯响应元件（T/GBOXATPIN2）和脱落酸响应元件（ABRE，DPBFCOREDCDC3，DRE2COREZMRAB17，MYB1AT，MYB2CON SENSUSAT）等；胁迫相关元件包括：低温响应元件（LTRECOREATCOR15），干旱响应元件（MARTBOX，MBS），防御和胁迫应答元件（TC-rich repeats），诱导物应答元件（W box）及伤害响应元件（WBOXATNPR1，WBOXNTERF3）等，说明该基因可能参与相应的激素应答及胁迫响应。

表2 白桦BpTCP10 基因启动子序列顺式作用元件预测结果Table 2 Prediction results of the cis-acting elements of BpTCP10 promoter

2.2 白桦BpTCP10 基因响应激素处理及非生物胁迫胁迫应答分析

参考BpTCP10基因启动子元件预测结果，选择相应的激素和非生物胁迫对野生型白桦幼苗进行处理，分析其表达特性。如图3所示，在ABA处理过程的中，BpTCP10基因的表达量呈现波动趋势，在2 h 时BpTCP10表达量达到最高，为0 h的27倍，在12 h 后达到最低水平，下调表达达到2-6倍；BpTCP10在JA 处理过程中始终呈现下调表达，在处理4 h 时达到最低，为2-7倍，此后表达量逐渐升高，但均低于0 h 时的表达量。

图3 不同激素及胁迫处理后各时间点白桦幼苗BpTCP10 基因的表达量Fig.3 Expression of BpTCP10 in B.platyphylla seedlings at different time points after the treatment with different hormones and stress

采 用CdCl2、NaCl、NaHCO3、PEG 4 种胁迫处理白桦幼苗，分析在不同非生物胁迫下BpTCP10的表达情况。结果表明，在CdCl2胁迫下，BpTCP10的表达始终呈现为下调趋势，在12 h 时达到最低，为2-4倍；在NaCl 胁迫中，整体呈现上调趋势，4 h 时表达量下调至低于0 h 时的水平，6 h 时最低，但未达到显著水平（＜2 倍）；NaHCO3胁迫下，BpTCP10的表达呈现下调趋势，2 h 时表达量最高，接近24倍，12 h 时下调表达最为显著，达到2-9倍。PEG 胁迫下，BpTCP10的表达量呈现波动趋势，2 h 时上调表达最高，接近26倍，之后表达量下调，24 h 时下调表达最为显著，达到2-10倍。

2.3 BpTCP10 基因组织表达特性分析

以各部位中BpTCP10基因在6月1日的表达量为对照，分析BpTCP10基因在一个生长季内各组织部位中的表达情况。结果表明：在叶中，初期BpTCP10基因的表达量变化不明显（＜2 倍），而在8月1日表达量显著下调，为2-2倍，在8月15日上调达到峰值，接近25倍；在茎节中，BpTCP10表达量整体呈现初期无变化，后期下调的趋势，尤其在9月1日和8月15日，表达量下调达到峰值（2-5倍）；在顶芽中，BpTCP10基因整体呈现下调表达趋势，其中，在9月1日的下调表达最为显著，达到2-6倍。在雄花序发育初期及4月30日，BpTCP10基因上调表达；其他时间点均主要呈现下调表达的趋势。在雌花序中，BpTCP10基因在4月25日和4月30日呈现上调表达，在4月25日表达量最高，为23倍（图4）。

图4 BpTCP10 基因在白桦各组织部位的表达量Fig.4 Expression of BpTCP10 in different tissues of B.platyphylla

2.4 转基因植株的获得

为了探究白桦BpTCP10的功能，本研究构建了35S::BpTCP10-SRDX 抑制表达载体，通过农杆菌介导法进行白桦遗传转化。通过潮霉素筛选，最终获得了6 个抑制表达株系。使用载体及基因引物对转基因株系进行PCR 检测。结果表明，抑制表达株系在849 bp 这一目标位置产生条带，而阴性对照未见条带，表明外源基因已成功整合至基因组中。通过qPCR 分析转基因株系的BpTCP10基因表达量，结果显示，6 个抑制表达株系中，除RTCP10-4 及RTCP10-5 外，其他4 个株系中BpTCP10的表达量均低于对照株系，其中，RTCP10-6 株系的BpTCP10基因下调表达最明显，达到了2-8倍（图5），其次为RTCP10-1和RTCP10-2。

图5 BpTCP10 抑制表达转基因株系的获得Fig.5 Acquisition of transgenic lines with inhibited BpTCP10 expression

2.5 BpTCP10 基因对白桦生长发育的影响

调查移栽2 个月的苗木生长量，结果发现：各株系间的苗高及地径均达到差异极显著的水平（P＜0.05）。转基因株系的苗高、地径均明显低于对照，尤其是RTCP10-2 及RTCP10-3 株系，其苗高和地径分别比对照株系低了21.6%、30.8%和9.5%、20.8%，转基因株系的平均叶面积与对照株系相比没有明显差异（图6）。

图6 转BpTCP10 抑制表达白桦株系与对照白桦的形态学分析Fig.6 Morphological analysis of transgenic lines with inhibited BpTCP10 expression and the control seedlings

2.6 BpTCP10 影响白桦的耐盐能力

细胞中H2O2释放出的氧离子能够氧化DAB，形成棕色沉淀。H2O2的含量越高，表明细胞受损越严重，染色就越深。NBT 能够被超氧离子O2-氧化形成蓝色的甲腙，甲腙颜色的深浅也能够反映出O2-含量的多少，超氧离子含量越高表明细胞受损越严重，叶片染色程度也越深[29]。

定量分析发现白桦BpTCP10基因响应NaCl胁迫应答，以BpTCP10抑制表达白桦株系的离体叶片为材料，预试验后，选取0.8%NaCl 进行胁迫处理，通过DAB 和NBT 染色分析转基因株系的耐盐能力。结果表明，随着NaCl 胁迫时间的延长，转基因及对照株系的DAB 染色均呈现不同程度的加深。但转基因株系的染色深于对照株系，尤其是RTCP10-2 株系，在胁迫过程中着色最重。NBT染色结果与DAB 结果相近，RTCP10-2 出现了最多的蓝色斑块，胁迫处理24 h 后，RTCP10-2 染色程度仍旧最深。BpTCP10抑制表达白桦株系表现为盐敏感，这表明BpTCP10基因在耐盐过程中可能起到了一定的作用（图7）。

图7 0.8% NaCl 胁迫下转基因株系的DAB 和NBT 染色结果Fig.7 DAB and NBT staining analysis of the transgenic lines treated with 0.8% NaCl

H2O2是信号物质，也是强氧化物，H2O2的含量也能够反应出细胞受损的程度。SOD 具有维持活性氧代谢平衡、保护膜结构的功能。当细胞的SOD 含量降低，不能有效地清除超氧离子，则容易引发氧化性破坏作用[28]。

本研究测定了转基因株系在盐胁迫过程中H2O2及SOD 含量变化，进一步探讨BpTCP10基因在抗盐过程中的功能。0 h 时，转基因株系与对照株系间的H2O2含量差异并不显著；处理12 及24 h 后，转基因株系的H2O2含量均显著高于对照株系，尤其是RTCP10-2 株系，在整个胁迫过程中的H2O2含量最高，处理12 h 的含量为对照株系的1.91 倍，24 h 为1.33 倍（图8）。SOD 的活性测定结果表明，0 及12 h 时，各株系SOD 活性差异并不显著，而24 h 时，除RTCP10-2 株系外，其他各株系的SOD 活性均有升高，但转基因株系的SOD 活性与对照差异不显著或低于对照，尤其是RTCP10-2 株系，12 和24 h 时SOD 的含量分别为对照株系的87.4% 和57.4%（图8）。由此可以推断，BpTCP10基因在植物盐胁迫响应过程中，很可能参与了对细胞膜透性和过氧化物代谢的调控，从而影响了植物的耐盐能力。

图8 0.8% NaCl 胁迫下不同时间不同株系的H2O2 和SOD 含量Fig.8 H2O2 and SOD contents during the 0.8% NaCl treatment

3 结 论

BpTCP10属于TCP转录因子家族中的PCF亚类，与拟南芥AtTCP11有一定的相似性；BpTCP10基因在叶、茎、顶芽、雄花序及雌花序中均有表达，尤其是在叶片中表达量最高，对BpTCP10抑制表达转基因株系进行NaC1 胁迫处理后，H2O2含量、SOD 含量、NBT 及DAB 染色结果均表明转BpTCP10基因在一定程度上影响了白桦的耐盐性。

4 讨 论

系统发育分析中的相似性越高，基因之间的功能就可能越接近。PCF 亚类基因的聚类分析表明，白桦BpTCP10与拟南芥AtTCP11聚到一个分支。而AtTCP11与AtTCP20存在功能冗余[30]，在拟南芥中，AtTCP20参与了叶细胞的生长和伸长过程，并且调节其他有关叶发育的基因[31]。本研究通过qPCR 分析发现，BpTCP10在茎、叶以及雄花序发育过程中的表达量有着显著变化，可以推断，白桦BpTCP10在植物体这些组织部位的营养生长过程中也起到一定的作用，BpTCP10在茎、顶芽和雄花序中整体呈现下调表达的趋势，而在叶和雌花序中上调表达，推测在植物不同组织部位的生长发育过程中，BpTCP10基因起到的功能是不同的，至于BpTCP10调控植物体营养生长的具体作用和机制，则需要进一步的研究来进行揭示。

本研究获得的6 个转基因株系中，有4 个株系中的BpTCP10基因的表达量均下调（RTCP10-1，RTCP10-2，RTCP10-3，RTCP10-6），但因RTCP10-6 株系的苗木数量没有达到符合试验要求的小样本量，所以并未选取这个株系进行相应分析，故选取RTCO10-1，RTCP10-2，RTCP10-3 这3 个株系进行后续的试验。在对这3个株系进行表型分析时，发现RTCP10-1 株系中BpTCP10基因的下调表达最为显著，但是苗高地径的减少较小；RTCP10-3株系中BpTCP10基因下调表达最不显著，但是苗高及地径的变化最大。这可能是因为TCP家族基因间存在功能冗余[32]导致的。Danisman 等[33]的报道中表明，在拟南芥中，AtTCP9 蛋白和AtTCP20 蛋白存在功能冗余，这两类蛋白均通过茉莉酸信号通路共同调控叶的生长。此外，AtTCP14和AtTCP15在调控拟南芥节间发育过程中存在功能冗余[14]。AtTCP6，AtTCP11及AtTCP20之间存在功能冗余[29]。在进化关系分析的结果中，虽然BpTCP10与AtTCP11聚到同一个分枝，但亲缘关系较远，且木本植物与草本植物之间，TCP家族基因行使的功能和途径也可能有所差别，此外，TCP 蛋白也可与多种非TCP 蛋白相互作用，参与调控为数众多的生命活动进程[34]。因此，我们推测虽然在转BpTCP10基因株系生长过程中，BpTCP10基因被抑制，但可能存在功能冗余的部分基因和通路共同调控茎的发育。这些基因的作用机理需要进一步的研究来揭示。

此外，TCP家族转录因子参与了一系列的植物防御反应[35-37]。拟南芥中，AtTCP8、AtTCP14、AtTCP15等参与了植物的胁迫响应和免疫反应[38,39,35]。目前，I 类TCP基因在非生物胁迫中的参与已经初步揭示。水稻中OsTCP14（PCF6）和OsTCP21的过表达或抑制表达分别显著降低或增加植株对于寒冷的敏感性，OsTCP14（PCF6）和OsTCP21负调控冷应激条件下ROS 介导的应激反应[18]。在非生物胁迫下，水稻OsTCP19的过表达上调了二酰甘油乙酰转移酶DGAT1关键基因的表达，引起转基因植物中脂滴（LDs）的积累，进而提高了植物的抗旱性[19]。在对大豆Glycine max，鹰嘴豆Cicer arietinum，菜豆Phaseolus vulgaris，蒺藜苜蓿Medicago truncatula和百脉根Lotus japonicus5 种植物的研究中，大多数TCP基因在干旱胁迫下下调表达，暗示了在干旱胁迫反应中，部分TCP基因可能具有相似的功能。这些结果表明，TCP基因在植物对非生物胁迫的响应中起着关键作用[40]。BpTCP10基因启动子区包含多个胁迫应答元件，NaCl 胁迫处理后BpTCP10的表达量发生显著变化，推测该基因可能参与了植物的非生物胁迫应答的过程。通过遗传转化获得的BpTCP10抑制表达白桦株系，分析转基因株系NaCl 处理后的生理变化也发现，抑制表达转基因株系表现为盐敏感，胁迫处理12 h 后，RTCP10-2株系的过氧化氢含量就野生型对照株系的近两倍，24 h 时，为对照组的1.33 倍；12 h 时，RTCP10-2株系的超氧化物歧化酶含量为对照株系的87.4%，24 h 时，下降到仅为对照株系的57.4%，表明在RTCP10-2 株系中，细胞膜透性和过氧化物的代谢明显受到了影响，说明BpTCP10基因可能参与植物的盐胁迫响应，但其调控机制需进一步深入研究。