桉树人工林土壤细菌群落对不同免炼山林地更新模式的季节动态响应

赵子麒，李一华，黄康庭，李 辉，唐亚斌，祝玲月，唐 健，石媛媛，林海能，王亚琼，陈利军，卢 胜，吴立潮

（1.中南林业科技大学 a.水土保持与荒漠化防治湖南省高等学校重点实验室；b.经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，湖南长沙 410004；2.国有大桂山林场，广西 贺州 542899；3.广西地源之本肥业有限公司，广西 南宁 530001；4.广西林业科学研究院，广西 南宁 530002；5.广西华沃特生态肥业股份有限公司，广西 南宁 530022）

近20年来，桉树作为我国3 大速生树种之一，在中国种植面积超过546 万hm2，以占我国2.5%的森林总面积生产超过全国总产量1/3 的木材。但是因为桉树的单一树种多代种植和短轮伐期的高强度经营方式，使得林地更新频繁，同时，桉树林地经营者仍使用传统的炼山整地[1]，此方法对土壤生态环境产生的巨大且长期的扰动，已引起社会广泛关注[2]，那么该如何对旧有方法进行改进？目前，保留采伐剩余物的方法被认为是减轻林地更新对土壤生态环境扰动的主要可行方法之一。但是保留采伐剩余物的免炼山管理模式对土壤生态环境的影响又该如何评估？土壤微生物因为对土壤养分转化与平衡、有机残留物的分解[3-6]的重要作用，被认为是对土壤生态环境研究的关键部分。此外，土壤细菌群落组成也随季节变化[7-12]，所以在不同季节下，土壤微生物群落又会产生何种动态变化？因此，对保留采伐剩余物的林地更新方式下的不同季节中的土壤微生物进行研究，对于解答本研究的疑问进而对桉树人工林可持续发展规划具有重要现实意义。

我国桉树人工林现行的纯林多代连栽模式被研究发现存在导致桉树人工林土壤各项化学指标、微生物生物量和酶活性下降的问题[13]。而多代种植之后，往往使用炼山即焚烧采伐剩余物的方法进行林地更新[14]。但炼山不仅会导致土壤养分的可利用性下降[15-16]，如研究发现炼山会平均造成桉树人工林土壤N、P、K、Ca、Mg 的501.6、10.5、26.8、21.7、21.5 kg/hm2的损失[17]，进而会导致生态环境的剧烈扰动，这不仅是因为炼山导致的地上生物多样性以及土壤微型和中型动物的丧失[18]，也和炼山导致的可能的化学元素的损失有关。比如氮被认为是不仅是植物生长的关键因素，陆地氮循环有关的关键过程由还原酶和氧化酶催化，其中微生物起主要作用，因此它的变化被认为也可以改变土壤微生物的结构和多样性[19-21]。植物的根系不仅会和土壤化学性质互相影响，其根系分泌物也会影响土壤微生物群落[22]。因此可以说，土壤微生物可以作为扰动引起土壤质量变化的早期指标[23]。而相关的在桉树人工林土壤的研究也证明多代连栽和炼山均会导致细菌群落产生变化[13-24]，因此，了解土壤微生物性质对不同林地更新模式的响应，有助于更好地维持保留剩余物管理措施下人工林土壤的健康，保证土壤的产出的可持续性[25]。

采取保留采伐剩余物的处理方式时被认为是缓解桉树人工林地力退化问题的有效措施[26]。采伐剩余物是森林采伐之后，不适宜加工为经济材、薪炭材和小规格材的所有废弃物[27]。不同采伐剩余物管理措施对土壤的扰动和改变，很大程度上体现在对土壤输入的有机残留物[28]，如研究认为在桉树人工林地进行免炼山，所有养分回归土壤后，相当于在1 hm2林地中施放33 t 腐殖质、582 kg 的大量元素复合肥料[17]。且已经有研究发现在杉木人工林地中皆伐后相比于炼山带状整地的土壤容重更低、孔隙度更高和改善化学性质更快[29-30]。同时保留采伐剩余物也会对土壤细菌群落产生显著影响[31]，如研究发现，经过网络分析后，尾叶桉人工林炼山的网络拓扑特征的平均度和图形密度低于保留采伐剩余物[32]。此外，季节变化对土壤微生物也会产生影响[7-12]，如Lacerda-Júnior 等在对巴西干旱森林土壤的研究中发现，土壤中放线菌和蓝藻在旱季显著富集，而变形杆菌、酸性细菌和类杆菌在雨季显著增加[33]。因此，季节也是在研究保留采伐剩余物不同处理方式时应考虑的影响因素之一。然而，现有关于不同采伐剩余物处理措施下在不同季节中对土壤微生物群落的结构和功能所造成的影响尚未得到评估和深入探究。

综上所述，本研究选取了在第3 代桉树人工林林地基础上重新营造的第一代尾巨桉桉树人工林，在调查不同处理土壤化学性质变化基础上，评价了3 种不同采伐剩余物处理方式（移除、平铺、堆放）下土壤样品的细菌群落结构及潜在功能变化。因此本研究提出如下假设：1）不同采伐剩余物处理方式会对土壤化学性质和微生物群落产生影响并产生差异性；2）在造林之后的一年中，不同采伐剩余物处理的土壤的化学性质会因为季节的变化而产生差异性变化；3）在保留采伐剩余物的处理方式下土壤肥力会随着时间而上升，土壤中的细菌群落会受到林地更新的影响而激活，并且会随着季节变化出现能量的释放使用和储存维持的现象。

为验证这些假设，本研究的主要目标是1）评价桉树人工林不同采伐剩余物处理方式对表层土壤化学性质细菌基因丰度的影响；2）评价不同采伐剩余物处理方式下营造的桉树人工林土壤细菌群落结构、优势菌群相对丰度及潜在功能；3）并研究各处理土壤化学性质与微生物群落结构之间的关系，寻找显著影响土壤细菌多样性的环境因子。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

研究区位于广西壮族自治区贺州市国有大桂山林场（111°20′05″～111°54′39″E，23°58′33″～24°14′25″N）。该地属湿润亚热带季风气候，年平均气温19.3℃，极端最高温39.7℃，极端最低温-2.4℃，年积温6 243℃；年平均降水量2 056 mm，年蒸发1 275 mm；年平均相对湿度82%；有霜期12 d。

试验点的土壤是由寒武系的砂岩发育而来的粉砂质黏壤土质地的富铝湿润富铁土。土层厚度在60～100 cm 之间，平均坡度25°，土壤肥力中等，总面积约333 hm2。2002年阔叶林砍伐后炼山造林，15年间第5年一次共3 次进行萌芽再生造林后砍伐。施肥量为每年复合肥料0.5 kg/株（N∶P∶K=15∶6∶9）。2016年12月5日 至12月22日营造第1 代尾巨桉Eucalyptus urophylla×E.grandis，品种DH32-29，植苗行距为2 m×3 m，种植密度为1 750 株/hm2，随后立即施基肥（液态碳肥+颗粒肥）第一年施0.5 kg/株30%有机肥，第2年到第4年施有机肥0.75 kg/株。采伐前的试验地为第3 代5年生尾巨桉人工林，于2016年10月至11月上旬采伐主干。2016年11月10日至12月3日在采伐迹地上进行免炼山林地清理。

1.2 标准地设置和试验设计

在上述研究区典型区域中选择14 hm2具有相似的自然条件的区域，于采伐前将研究区布置为3个大小相似的随机区组，在每个区组中各建立3 种处理的一块样地，营造尾巨桉人工林，即每种处理均设置3 块大小为20 m×20 m 的重复。3 种处理方式具体如下：1）平铺处理（简称E）为将采伐剩余物按采伐时状态均匀自然铺于林地；2）堆放处理（简称S）为将剩余物沿山坡等高线以两行树苗为行距按2×3m 条形堆积在林地表面；3）移除处理（简称R）为将采伐剩余物全部移出林地；4）以采伐前的第3 代桉树人工林作为对照（简称H）。

1.3 土壤样品的采集与处理

于采伐前的第3 代桉树人工林（2016年11月，简称H）、春季（2017年5月，简称R1、E1、S1）、夏季（2017年8月，简称R2、E2、S2）、秋季（2017年11月，简称R3、E3、S3）和冬季（2018年2月，简称R4、E4、S4）采集样方内土壤表层（0～20 cm）样品。样方取样时，在每个标准地中，先去除土壤表层的腐殖质及杂质，在每个样地中于0～20 cm 土层随机收集五个子样本，并均匀混合以形成大样本。分两部分带回实验室：一部分5～10 g 鲜土装入10 mLPE 管作标记后放入-80℃液氮罐保存，用于细菌群落的测量；另一部分约1 000 g装入塑封袋，实验室自然风干，磨碎，分别过2、1 和0.149 mm 筛，用于测土壤化学性质。

1.4 土壤化学性质的测定

根据Ling 等[34]的方法，使用去离子水和土壤混合（1∶2.5 土壤/水，w/v）的悬浮液中测定土壤pH 值。使用重铬酸钾法[35]，用定量的重铬酸钾-硫酸溶液，氧化土壤中的有机碳，剩余的重铬酸钾用硫酸亚铁标准溶液滴定，计算出土壤有机质（SOM）。使用凯式定氮法[36]，使土壤中的全氮在加速剂的作用下，用浓硫酸将全氮转化为铵态氮后用氢氧化钠碱化，加热蒸馏出来的铵用硼酸吸收，以求出土壤全氮（TN）含量。通过氢氧化钠熔融测量全磷（简称TP）和全钾（简称TK），然后进行比色分析[37]，如用0.5 mol/L NaHCO3（pH 值8.5）提取可用的磷并用比色法定量。在氢氧化钠熔融后通过火焰光度法测量土壤全钾。

1.5 DNA 提取和PCR 扩增及测序

取样后，采用CTAB 方法从0.5 g 解冻土壤样品中提取DNA并使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，在细菌16S rRNA 基因扩增中使用引物对338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）。进行PCR，将同一样本的PCR 产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR 产物，进行回收产物纯化后，进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，并进行回收产物检测，定量。使用试剂盒进行建库后利用Illumina 公司的Miseq PE300 平台进行测序。将所有样本序列进行聚类，后根据序列之间的相似性将序列分成不同的操作分类单元（OTU），通常对97%相似水平下的OTU 进行生物信息统计分析。在OTU基础上，计算各个样品多样性指数，对97%相似水平的OTU 代表序列进行分类学分析，阈值设置为0.8，并分别在各个分类水平上统计样本的群落物种组成。

1.6 实时荧光定量PCR 分析

采用上述细菌通用引物对不同土壤样品进行荧光定量PCR，用以确定细菌16s 基因拷贝数量。在PCR 仪中，PCR 反应采用以下程序进行：95℃变性5 min，然后95℃循环35 次，30 s；53℃退火30 s；72℃延长时间60 s。每个PCR 反应包含：10 μL 2X Taq Plus Master Mix，各0.8 μL5 μmol 正向与反向引物，7.4 μL dd H2O 和1 μL 模板DNA。标准曲线用十倍梯度稀释构建好的含有目标基因的质粒得到的，利用回归方程计算细菌rRNA 基因的拷贝数，将循环阈值（Ct）转换为标准中已知的拷贝数。荧光信号在PCR 过程中自动检测。

1.7 微生物功能预测

为了识别样本功能组，利用Tax4Fun 0.3.1 软件包对16S rRNA 数据进行功能预测[38]。将基于Silva 数据库的16S 分类谱系转化为KEGG 数据库[39]中原核生物的分类谱系；然后使用16S 拷贝数对相应的KEGG 数据库中原核生物的丰度进行标准化；最后利用均一化丰度数据，并结合KEGG 数据库中原核生物与Silva 数据库中16S分类谱系的对应关系，对原核生物微生物群落的KEGG 功能预测。根据KEGG 数据库的信息，可以获得Pathway 信息，并能根据OTU 丰度计算各功能类别的丰度。

1.8 数据分析

所有统计分析均使用R 软件3.4.3 版（R Core Team，2017）进行。使用基于Windows 的SPSS软件v19.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）进行单向ANOVA（单因素方差分析）用于测试不同保留采伐剩余物方式利用和采样时间对土壤化学性质的影响。在整个分析中使用的数据均来自同一样地所取3 次重复样品的读数的平均值。先使用Good 的覆盖率用于确定细菌群落的序列覆盖率。α 多样性研究方法为利用Chao1 和Simpson 的均匀度指数与Ace 和Shannon 多样性指数分别研究了土壤微生物群落的丰富度与均匀度。之后使用基于系统发育的加权weighted-unifrac 距离[40]完成对β-多样性比较后,使用主坐标分析（PCoA）用图表视觉化样品之间的差异。相关性 Heatmap 分析通过计算环境因子与所选物种之间的Spearman 相关系数，将获得的数值矩阵通过Heatmap 图直观展示。

2 结果与分析

2.1 土壤化学性质

桉树人工林采伐剩余物的不同利用方式对土壤化学性质产生显著影响，移除处理的化学性质表现出更为低于采伐前和其他处理方式，最高养分含量均出现在E 处理中，最低值则出现在R 处理中，但是差异大多不显著（表1）。有机质指标最高值出现在E4，最低值出现在R1。pH 值指标最高为H，最低为E2。全氮和全磷最高的为H，最低出现在R1，全钾最高为E2,最低为R1。在全氮指标R、E 和S 处理中均观察到在随采样时间变化而显著上升（P＜0.05），但没有观察到土壤有机质、pH 值、全磷、全钾的性质随时间出现显著上升（P＞0.05）。

表1 采伐前和3 种采伐剩余物管理的土壤化学性质†Table 1 Soil chemical properties before harvesting and management of three logging residues

2.2 不同采伐剩余物处理方式对土壤细菌群落α多样性影响

土壤微生物群落多样性、丰富度表现为对不同采伐剩余物处理方式的差异性响应，其中移除处理的指数变化相比于其他处理更加显著与剧烈（图1，P＜0.05）。本研究在共39 个样品中提取细菌基因序列，其中有效序列数范围为35 451～65 774，平均序列数为45 918.05。经过质量过滤和重采样后，以97%的序列相似性基于所有样本中最小样本序列数确定了5,105 个OTU。通过方差分析的指数组间差异检验，揭示了不同采伐剩余物处理和采样时间之间的细菌群落多样性指数和丰富度指数（ACE 丰富度，Chao 1 丰富度，Shannon 多样性，Shannon 均匀度）。不同采伐剩余物处理方式对比显示，Ace 和Chao 1 丰富度指数最低的3 个指数从低到高依次是R3、R4、S2，最高值出现在S1。Shannon 多样性指数最低的3个指数从低到高依次是R1、H、S2，最高值出现在E4。Shannon 指数随造林时间延长按春夏秋冬顺序而逐渐升高。Simpson 均匀度指数最低的3 个指数从低到高依次是R2、S4、E4，最高值出现在R1。与Ace 和chao 丰富度指数相似，Shannon 指数随造林时间延长按春夏秋冬顺序而逐渐下降。

图1 采伐前和3 种采伐剩余物管理的土壤细菌群落α 多样性指数Fig.1 α diversity index of soil bacterial communities before logging and management of three logging residues

2.3 不同采伐剩余物处理方式和季节的动态变化对土壤细菌群落β 多样性影响

对土壤细菌群落β 多样性分析，揭示了季节和处理方式均对微生物群落有显著影响，其中季节影响更显著。基于weighted-unifrac 距离进行PCoA 分析（图2），第一主成分（PC1）能够解释51.45%的样本，第二主成分（PC2）能够解释17.56%的样本。3 种处理方式的OTU 在春季时仍有较高相似度，但是在夏季时群落分离程度开始增大，到秋季和冬季时，OTU 间仍然呈现较大程度分离。从图2可知，在PCoA1 轴上，春夏时3 种处理方式的群落与秋冬时的3 种处理方式群落明显分离。在PCoA2 轴上，除了R2 群落与其他采样明显分离，3 种处理方式的群落在同一季节时差异有限。PERMANOVA 分析表明，季节（R2=0.39013，P=0.001）和处理方式（R2=0.1277，P=0.021）对细菌群落的结构有显著（P＜0.05）影响。

图2 根据采伐前和3 种采伐剩余物管理基于weighted-unifrac 距离的PCoA 分析Fig.2 PCoA analysis based on weighted-unifrac distance according to pre-logging and three kinds of logging residue management

2.4 土壤细菌群落组成

土壤中的细菌群落在不同采伐剩余物处理方式和不同季节的影响下，细菌群落丰度呈现季节性动态变化，但细菌群落中的优势菌群基本相同（图3）。土壤细菌群落有4 种相对丰度大于5%的优势菌群分别为：变形菌门Proteobacteria（29%～43%），酸杆菌门Acidobacteria（25%～42%）、绿弯菌门Chloroflexi（4%～17%）和放线菌门Actinobacteria（4%～12.5%）。还有4 种相对丰度大于2%的门，按丰度降序排列为厚壁菌门Firmicutes，疣微菌门Verrucomicrobia，浮霉菌门Planctomycetes，以及一种未分类菌Unclassified。在不同的处理和采样时间上，优势菌群基本相同，但丰度具有较大差异。

图3 Circos 样本与物种关系图谱Fig.3 Circos relationship between sample and species

对相对群落占比可能大于2%的细菌群落进行门水平分析发现，3 种采伐剩余物处理方式均显著降低Acidobacteria的相对丰度，其中E 处理最大。3 种采伐剩余物处理方式均显著降低Proteobacteri、Firmicutes、Verrucomicrobia的相对丰度，且其中R 处理下降幅度最大。3 种采伐剩余物处理方式均显著降低unclassified的相对丰度，其中S 处理最大。3 种采伐剩余物处理方式均使得Chloroflexi、Actinobacteria的相对丰度显著上升，且其中R 处理上升幅度最大。3 种采伐剩余物处理方式使得Planctomycetes的相对丰度显著上升，且其中E 处理上升幅度最大。而在不同季节中，Chloroflexi相比于对照均含量显著增加，其中冬季最大。Planctomycetes相比对照含量均显著增加，其中秋季最大。Firmicutes、unclassified相比对照均含量显著降低，其中秋天最低。Verrucomicrobia相比于对照含量均显著降低，其中以冬天最低。

2.5 相关性Heatmap 分析

Heatmap 分析了揭示环境因素对主要微生物群落的影响，pH 值，TN，TP，SOM 含量是影响土壤细菌群落结构的主要环境因子，这些环境因子同5 种土地利用方式的土壤优势种群显著相关（图4）。其中pH 值和Proteobacteria、Firmicutes正相关，和Actinobacteria显著正相关，和Planctomycetes负相关。TN 和Planctomycetes显著正相关，和Acidobacteria、Firmicutes负相关，和Proteobacteria、unclassified显著负相关，TP 和Actinobacteria显著负相关。SOM 和Actinobacteria、Proteobacteria负相关。

图4 土壤化学性质和细菌群落的Spearman 相关性Heatmap 分析Fig.4 Heatmap analysis of Spearman correlation between soil chemical properties and bacterial community

2.6 土壤细菌功能贡献预测

基于Tax4Fun 工具从16S rRNA 数据推断不同改造措施土壤中细菌的功能贡献，尽管各处理间分类功能图谱较为相似，不同季节之间仍然存在20 条代谢通路的基因表达量差异达到显著水平（Fig.6 ,P＜0.05）。所有土壤样品共获得6 565 KEEG Orthologues (KO)，主要属于Metabolism,Environmental Information Processing,Genetic Information Processing 以 及Cellular Processes 等功能通路（Fig.5.A Fig.6.A）。与其他2 级功能通路 相比，Membrane transport,Signal transduction,Carbohydrate metabolism,Amino acid metabolism,Energy metabolism,Metabolism of cofactors and vitamins,Xenobiotics biodegradation and metabolism,Nucleotide metabolism,Translation,Lipid metabolism等功能通路相对丰度大于3.5%（Fig.5.B Fig.6.B）。尽管大部分功能通路基因丰度在不同处理间基本保持相对一致性，但在27 条相对丰度大于1%的3 级功能通路中，20 条与代谢相关的功能通路表达量存在显著差异（P＜0.05），其中8 条通路的基因表达量表现为采伐前、春季和夏季显著高于秋季和冬季。1 条通路的基因表达量表现为采伐前、春季、夏季和冬季显著高于秋季，2 条通路的基因表达量表现为采伐前、春季、夏季和秋季显著高于冬季。6 条通路的基因表达量表现为秋季和冬季显著高于采伐前、春季和夏季。2 条通路的基因表达量表现为秋季显著高于采伐前、春季、夏季和冬季。1 条通路的基因表达量表现为冬季显著高于采伐前、春季、夏季和秋季。

图6 Tax4Fun 分析（a.功能类别1；b.功能类别2）的不同季节间桉树人工林土壤样品中细菌功能贡献预测Fig.6 Functional contribution prediction of bacteria in soil samples of Eucalyptus plantation in different seasons by Tax4Fun (a.functional category 1;b.functional category 2)

3 结论与讨论

3.1 免炼山对土壤化学性质的影响

研究发现在3 种采伐剩余物处理方式中，最高的养分含量均出现在E 处理，而最低均出现在R 处理中，3 种保留采伐剩余物的处理的化学性质春季均低于采伐前，但是随时间变化，3 种处理的化学性质均呈现上升恢复的趋势（表1）。这说明保留采伐剩余物的林地更新方式确实对土壤养分产生影响，且将采伐剩余物平铺的方式相对地更有利于土壤养分恢复。在全氮指标R、E 和S 处理中均观察到在随采样时间变化而显著上升（P＜0.05）。此外，虽然在冬季时氮磷钾性质都呈现平铺处理显著更高，在之前的采样时间中都是平铺处理有差异不显著的相对最高值。这也与之前的一项研究的发现相似，类似的土地利用类型具有相似的土壤化学特性[41]。先前的研究还表明，动物堆肥通过增加土壤的碳库来增加细菌和真菌的多样性，从而改善土壤微生物种群的生活条件[42]。而堆肥（免耕）和免炼山对采伐剩余物的处理方式存在相似之处，同样影响土壤有机碳。而土壤有机碳与土壤微生物生物量高度相关[43]。也有研究称土壤微生物活性的增加与高土壤有效氮有关[44]。以前的研究表明，P 缺乏是红壤作物生长的关键制约因素。而本研究的3 种免炼山处理都有同样使用了30%有机肥，这可能是导致土壤化学性质差异不显著的原因之一。而采伐剩余物和有机肥的随时间推移逐步分解也可能是全氮含量显著上升现象的原因。

3.2 不同采伐剩余物处理方式和环境条件对土壤微生物群落多样性的影响

本研究发现，在土壤微生物的绝对丰度变化上，Ace 和Chao1 丰富度最低值有两个出现在R处理，而且是秋冬季（图1），这可能是因为移除了采伐剩余物导致了土壤暴露，导致了最低值出现。而S1 的最大值可能说明堆放处理在雨季到来之前的春季给土壤微生物提供了一个较高保护度的环境。Shannon 多样性因为最低值出现在采伐前的H 和采伐后春季的R1，某种程度上反映了土壤细菌群落的受破坏程度，因此当Shannon 指数最大值出现在E4 中，某种程度上可以说明E 处理在冬季时处于最大程度的混乱。Simpson 均匀度指数最高的两个值是H 和R1，和Shannon 指数一样，也在某种程度体现了，均匀度越高，土壤细菌群落越复杂越均匀。而最低值出现在R2，这可能是因为经历了雨季，移除处理R 中的细菌群落因为缺少采伐剩余物的保护，受到了巨大的扰动。此外，E 和R 处理在冬季均有相对较高的丰富度和相对较低的均匀度，这可能说明，在丰富度回升的过程中，导致了必然的短期混乱，即均匀度下降。因此可能需要时间跨度更大的研究来探究土壤细菌群落组成炼山后的变化。

在使用基于weighted-unifrac 距离的PCoA 分析β 多样性后，本研究发现3 种不同处理方式和采伐前的细菌群落在春季时仍有较高相似度，但是在夏季时群落分离程度开始增大，到秋季和冬季时，3 种处理方式之间的群落间仍然呈现较大程度分离。PERMANOVA 分析进一步表明，季节和处理方式均对细菌群落的结构有显著影响。先前已有研究已发现到微生物群落结构的季节性变化[45-46]，但是Jangid 等[47]的研究表明，营养物质输入对微生物群落结构的影响大于季节。在这项研究中，土壤微生物群落结构与土壤资源相关的事实表明微生物群落可能对资源投入的变化更敏感。此研究结果也证实了其他研究人员的结果，土壤细菌群落组成与土壤和植物性质以及植物-微生物相互作用相关[48-49]。残留物管理处理确实影响了土壤微生物组[50]。这与其他研究结果一致，这些研究在较少扰动的耕作制度下观察到较高的微生物群落Shannon 多样性[51]。同时本研究也和其他研究有相似的发现，Nevins 等的研究表明：在处理方式之间的对比时，不同残留物管理处理对β 多样性没有显著影响[52]。

3.3 不同采伐剩余物处理方式对土壤细菌群落结构改变及潜在功能预测

在3 种处理中，Proteobacteria相对丰度的最低值出现在R 处理中，而最高出现在E 处理中（图3），与之前对于土壤质量的研究相符合，且本研究发现Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi和Acidobacteria4 种菌门均易受到季节变化的影响。Actinobacteria被认为参与了有机物的降解，与Proteobacteria一同被认为具有在营养充足环境下活性增大的特性，在土壤有机碳含量高的条件下蓬勃发展[53-58]，而本研究发现，造林后3 种处理方式均会导致Proteobacteria的相对丰度下降，而R 处理中的Proteobacteria的下降幅度最大，3种处理方式之间E 最大，这也与之前研究结果相符，林地更新均会导致土壤影响损失，而3 种处理中R 处理中土壤营养含量最低，而E 处理相对最高。而Proteobacteria在本研究中却与TN 极显著负相关（图4），这可能是由于季节变化使得TN 的增加反而抑制了Proteobacteria，因为在本次试验中，旱季（秋季和冬季）中Proteobacteria的相对丰度显著低于雨季（春季和夏季）。而与之相反的情况出现在Actinobacteria上，该菌门出现了和TP 的显著负相关，且Actinobacteria菌门在旱季中的相对丰度显著高于雨季。这也和前人关于相近降雨状况的研究存在相似之处[59-62]，如巴西卡廷加森林的土壤中雨季中Proteobacteria，Acidobacteria和Bacteroidetes的增加相反，干旱季节发现了Actinobacteria和Cyanobacteria的显著富集[33]。而Chloroflexi和Acidobacteria两个菌门被认为和有机物降解如纤维素有关[63,64]，如前人研究发现Chloroflexi相对丰度同土壤有机质含量存在负相关关系[65,66]，但是本研究结果与前人结果存在差异，这可能是因为此两个菌门也与干湿季节有关，而受干湿季节影响这一点在Acidobacteria上也有所体现，旱季中Acidobacteria的相对丰度显著低于雨季。

为了能够更深入了解人工林改造措施对林地土壤细菌群落的影响，本研究采用预测效果优于PICRUST 的Tax4Fun 对各处理进行原核生物微生物群落KEGG 功能预测[38]。与以往类似研究结果相似[67]，本研究发现不同处理细菌metabolic category 相对丰度具有高度一致性，这可能归因于土壤中众多不同类型细菌具有相似的核心功能[68]。本研究表明，土壤细菌参与了多条KEEG 途径（图5～6），大多数细菌与代谢途径有关。本研究发现相对丰度大于1%的26 条3 级功能通路中，有20 条在4 个季节之中表达的功能通路基因丰度出现显著差异。总体来说，在采伐前和雨季（春季和夏季）中基因表达量大于旱季（秋季和冬季）通路中，主要功能为环境信息处理中的信号转导、代谢中的核苷酸嘌呤代谢与碳水化合物代谢、细胞的运动生长和死亡有关，均与营养物质的消耗和细菌群落的生长扩张有关。而在旱季（秋季和冬季）通路中基因表达量较大的通路，功能与环境信息处理的膜转运、代谢中的氨基酸代谢、新陈代谢中的能量代谢和辅因子和维生素的代谢有关，从通路名称可以看出这些通路都与能量的储存和细菌群落的能量平衡有关。这一结果也进一步验证了本研究的假设，土壤中的细菌群落确实会受到林地更新的影响而激活，并且会随着季节变化出现能量的释放使用和储存维持的现象。

图5 Tax4Fun 分析（a.功能类别1；b.功能类别2）的不同采伐剩余物处理方式间桉树人工林土壤样品中细菌功能贡献预测Fig.5 Functional contribution prediction of bacteria in soil samples of Eucalyptus plantations under different logging residue treatments analyzed by Tax4Fun (a.functional category 1;b.functional category 2)

3.4 对采伐剩余物管理工作的启示

本研究之所以独特，是因为它探索了不同采伐剩余物处理方式和季节对土壤化学性质和细菌群落结构和多样性影响，从而改善了土壤生物环境和肥力。本研究中揭示了不同的采伐剩余物处理方式会较大影响土壤的化学和微生物特性。通过对土壤化学性质的研究，本研究发现，相对而言E 处理能最大程度地恢复土壤肥力，而R 处理恢复土壤肥力的能力相对最差。而在对土壤微生物多样性的研究中，研究发现R 处理会导致土壤微生物丰富度在夏季至秋季间出现大幅下降，均匀度会在春季至夏季间大幅下降，这种变化幅度极大的曲线很可能暗示了R 处理下的土壤环境十分不稳定。因此根据本研究结果，不建议继续使用移除采伐剩余物的处理方式，而平铺采伐剩余物处理方式是三者中相对更好的选择。

而对土壤化学性质和细菌群落的相关性分析发现了，TN 不仅对于桉树的生长有重要作用，也对土壤细菌群落的变化有着很大的影响力。但是关于土壤氮和细菌群落之间的相互影响机制的研究仍然不够深入，因此基于本研究的启示是，及时监控土壤N 含量变化和细菌群落的变化，因为现在的研究并不能排除存在过量的N 添加如施肥导致土壤细菌群落失衡的风险。

3.5 不同采伐剩余物管理方式差异性探讨的阶段性总结和展望

本研究结果表明，对比3 种采伐剩余物处理方式化学性质变化，发现随时间变化，3 种处理的化学性质均呈现上升恢复的趋势。且恢复速度上是E＞S＞R。3 种采伐剩余物处理方式在秋冬季相比于采伐前降低了细菌群落的丰富度和均匀度并增加了多样性，其中R 处理的变化幅度最大。在3 种处理中，Proteobacteria相对丰度的最低值出现在R 处理中而最高出现在E 处理中，且Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi和Acidobacteria4 种菌门均易受到季节变化的影响。在采伐前和雨季（春季和夏季）中基因表达量大于旱季（秋季和冬季）通路均与营养物质的消耗和细菌群落的生长扩张有关，而在旱季（秋季和冬季）通路中基因表达量较大的通路，功能与环境信息处理的膜转运、代谢中的氨基酸代谢、新陈代谢中的能量代谢和辅因子和维生素的代谢有关，从通路名称可以看出这些通路都与能量的储存和细菌群落的能量平衡有关。pH 值和Actinobacteria、unclassified显著正相关。TN 和Planctomycetes显著正相关，和Proteobacteria、unclassified显著负相关，TP 和Actinobacteria显著负相关，说明了氮含量变化和土壤细菌群落变化值间存在重要联系。综上所述，采用平铺采伐剩余物处理方式是三者中相对更优的选择。而关于土壤N 含量变化和细菌群落的变化之间的深层机制需要进一步研究探讨。