大蒜素调控PI3K/Akt/Nrf2通路对大鼠子宫内膜异位症的影响

董秀娟， 曹若愚， 于洪基， 窦素棉

(河北省沧州市中心医院产科， 河北 沧州 061000)

EMs是最常见的妇科疾病之一，与育龄期女性50%的不孕症及80%的痛经有关，并且EMs作为一种良性疾病，却具有恶性肿瘤般侵袭及远处转移的能力，给女性造成极大的生理和心理负担[1]。EMs发病机制复杂，有研究发现腹腔局部乏氧及炎性微环境在EMs疾病进展过程中发挥着重要作用[2]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/核因子E2相关因子2(PI3K/Akt/Nrf2)通路对机体氧化应激和炎症反应发挥着重要调控作用[3]。大蒜素是由百合科葱属植物大蒜的鳞茎中提取的一种二烯丙基三硫化物，具有抗炎、抗氧化、调节免疫力等多种药理学作用[4]；并且大蒜素能够通过调控PI3K/Akt通路抑制烧伤创面氧化应激和炎症反应[5]。本研究通过自体内膜移植的方法制备大鼠EMs模型，探讨大蒜素对EMs大鼠的治疗作用以及对PI3K/Akt/Nrf2通路的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物:SPF级雌性SD大鼠45只，7周龄，体质量170g～200g，购自河北省实验动物中心[实验动物生产许可证号：SYXK(冀)2018-004]。分笼饲养于沧州医学高等专科学校[实验动物使用许可证号：SYXK(冀)2019-006]，饲养环境温度23℃～25℃、相对湿度50%～70%、光照时间12h，实验方案经沧州市中心医院医学伦理委员会审核批准。

1.2药物与试剂:大蒜素注射液购自上海禾丰制药有限公司(批号：20200416)；PI3K特异性抑制剂LY294002购自英国Abcam公司(批号：ab120725)；戊酸雌二醇片购自拜耳医药保健有限公司(批号：J20190812)。HE试剂盒购自河北博海生物有限公司(批号：20200104)；肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、干扰素γ(Interferon-γ，IFN-γ)酶联免疫吸附(ELISA)法检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(批号：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005、SEKRT-0008)；丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(批号：BC0020、SEKR-0073、BC0170、BC0200)；兔源Akt、磷酸化(p-Akt)、Nrf2、血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)、核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)、β-肌动蛋白(β-actin)抗体和羊抗兔IgG二抗购自北京博奥森生物科技有限公司(bsm-52010R、bsm-52129R、bs-1074R、bs-23397R、bs-23217R、bs-0061R、bs-0295G)；ECL超敏发光试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(批号：SW2030)。

1.3主要仪器:Vevo2100型小动物超声仪(加拿大Visual Sonics公司)；UV2000型分光光度计(上海尤尼柯公司)；Varioskanlux型多功能酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；RM2125型石蜡切片机(德国Leica公司)；AI09型光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；VE180型电泳槽、VE186型转膜仪(上海天能科技有限公司)；GelDoc2000 凝胶成像系统(美国 Bio-Rad公司)。

1.4方 法

1.4.1EMs大鼠模型制备:取35只实验用大鼠，参照文献[6]报道的自体内膜移植法制备EMs大鼠模型：造模前3d开始1次/d灌胃给予戊酸雌二醇(0.1mg/kg)，以调节大鼠动情周期使其同时发情；腹腔注射10%水合氯醛(3.5mL/kg)实施麻醉后，于尿道上端约2cm处开腹、暴露左侧子宫，结扎左侧子宫角并剪取约1cm长度的子宫，置生理盐水中并剪成0.5cm×0.5cm子宫内膜组织块，将其移植到右侧腹壁皮下筋膜层、腹壁肌层之间，逐层缝合，常规饲养；假手术组行模型组相同的手术通路、结扎并切除左侧子宫角，但不进行自体移植。4周后，通过小动物超声仪检测，腹壁下方可见暗灰色低回声区，即为异位病灶，病灶内黑色无回声区则提示病灶内有液体，通过图像分割测量异位病灶体积≥50mm3，则认为造模成功(图1)。

图1 EMs模型大鼠异位病灶超声检查结果

1.4.2分组与给药:取30只模型大鼠按照随机数字表法分为模型组，大蒜素组和大蒜素+LY294002组；另10只大鼠设为假手术组。大蒜素组腹腔注射给予10mg/kg的大蒜素溶液(根据临床人有效剂量折算大鼠用量)，大蒜素+LY294002组腹腔注射给予10mg/kg的大蒜素溶液加40mg/kg的LY294002溶液，假手术组和模型组腹腔注射给予生理盐水，腹腔注射体积均为5mL/kg，给药频次均为1次/d，疗程4周。

1.4.3子宫内膜异位病灶体积的测量及盆腔粘连评分:末次给药6h后，实施麻醉后开腹，取假手术组大鼠在位子宫内膜组织及其它组大鼠内膜异位病灶，用生理盐水冲洗干净后，通过卡尺测量异位病灶的长(mm)、宽(mm)、高(mm)，然后按椭球体积计算公式计算病灶体积(V)，V(mm3)=0.52×长×宽×高；根据Haber评分法进行异位病变的盆腔粘连评分。

1.4.4HE染色法行子宫内膜组织病理学检查:取部分在位(假手术组)子宫内膜组织或子宫内膜异位病灶组织，置4%多聚甲醛溶液72h后，依次进行常规石蜡包埋、5μm厚度切片、梯度乙醇脱蜡水化后行HE染色，用中性树脂封片后通过光学显微镜观察子宫内膜组织或内膜异位病灶组织病理学改变。

1.4.5ELISA法检测子宫内膜组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量:取部分在位(假手术组)子宫内膜组织或子宫内膜异位病灶组织，在冰上剪碎后匀浆，4℃、3000rpm离心10min后取上清液，然后按照ELISA试剂盒说明检测子宫内膜组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量。

1.4.6生化分析法检测子宫内膜组织中MDA含量和MPO、SOD、CAT活力:取“1.4.5”制备的组织匀浆上清液，按照试剂盒说明检测子宫内膜组织中MDA含量和MPO、SOD、CAT活力。

1.4.7Western blot法检测子宫内膜组织Akt、p-Akt、Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表达:取每只大鼠约50mg在位子宫内膜组织或子宫内膜异位病灶组织，加入4℃预冷裂解液后匀浆，冰上静置30min提取总蛋白，4℃、12000rpm离心20min后取上清液，BCA法检测总蛋白浓度，每孔等量上样后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿法转PVDF膜，加5%脱脂奶粉溶液室温封闭2h，洗膜后滴加Akt(1∶1000)、p-Akt(1∶1000)、Nrf2(1∶800)、HO-1(1∶1000)、NF-κB(1∶1000)、β-actin(1∶3000)抗体4℃孵育过夜，洗膜后滴加IgG二抗(1∶5000)室温孵育1.5h，洗膜后滴加ECL后通过凝胶成像系统显示蛋白条带，以目标蛋白条带灰度值与β-actin(内参)条带灰度值的比值半定量目标蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1大蒜素对EMs大鼠子宫内膜异位病灶体积和盆腔粘连评分的影响:与模型组相比，大蒜素组和大蒜素+LY294002组子宫内膜异位病灶体积明显缩小、盆腔粘连评分降低(P<0.05)；与大蒜素组比较，大蒜素+LY294002组异位病灶体积增大、盆腔粘连评分升高(P<0.01)，见表1。

表1 大蒜素对EMs大鼠子宫内膜异位病灶体积和盆腔粘连评分的影响±s)

2.2大蒜素对EMs大鼠子宫内膜病理学改变的影响:假手术组在位子宫内膜柱状上皮细胞和间质细胞排列整齐、致密；模型组子宫内膜异位病灶柱状上皮细胞排列整齐、间质细胞致密、新生血管明显增生等病理学改变；大蒜素组上皮细胞脱落、间质疏松、新生血管明显减少；与大蒜素组比较，大蒜素+LY294002组上皮细胞脱落、间质疏松程度加重，新生血管明显增多。见图2。

图2 大蒜素对EMs大鼠子宫内膜病理学改变的影响(HE染色，×200倍)注：A.假手术组；B.模型组；C.大蒜素组；D.大蒜素+LY294002组

2.3大蒜素对EMs大鼠子宫内膜组织TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量的影响:与假手术组在位子宫内膜相比，模型组子宫内膜异位病灶TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量升高(P<0.01)；与模型组相比，大蒜素组子宫内膜异位病灶TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量降低(P<0.05或P<0.01)；与大蒜素组相比，大蒜素+LY294002组TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量降低(P<0.01)。见表2。

表2 大蒜素对EMs大鼠子宫内膜组织TNF-α IL-1β IL-6 IFN-γ含量的影响 ±s)

2.4大蒜素对EMs大鼠子宫内膜组织MDA含量和MPO、SOD、CAT活力的影响:与假手术组在位子宫内膜相比，模型组子宫内膜异位病灶MDA含量升高而MPO、SOD、CAT活力降低(P<0.01)；与模型组相比，大蒜素组和大蒜素+LY294002组子宫内膜异位病灶MDA含量降低且MPO、SOD、CAT活力升高(P<0.05或P<0.01)；与大蒜素组相比，大蒜素+LY294002组MDA含量降低且MPO、SOD、CAT活力升高(P<0.01)。见表3。

表3 大蒜素对EMs大鼠子宫内膜组织MDA含量和MPO SOD CAT活力的影响±s)

2.5大蒜素对EMs大鼠子宫内膜组织Akt、p-Akt、Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表达的影响:与假手术组在位子宫内膜相比，模型组子宫内膜异位病灶p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白表达下调且p-Akt/Akt降低(P<0.01)，NF-κB蛋白表达上调(P<0.01)，Akt表达差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组相比，大蒜素组和大蒜素+LY294002组子宫内膜异位病灶p-Akt、Nrf2、HO-1表达上调且p-Akt/Akt升高(P<0.01)，NF-κB表达下调(P<0.01)，Akt表达差异无统计学意义(P>0.05)；与大蒜素组相比，大蒜素+LY294002组Nrf2、HO-1蛋白表达下调且p-Akt/Akt降低(P<0.01)，NF-κB表达上调(P<0.01)，Akt表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、表4。

图3 大蒜素对EMs大鼠子宫内膜组织Akt、p-Akt、Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表达的影响注：A.假手术组；B.模型组；C.大蒜素组；D.大蒜素+LY294002组

表4 大蒜素对EMs大鼠子宫内膜组织Akt p-Akt Nrf2 HO-1 NF-κB蛋白表达及p-Akt/Akt的影响±s)

3 讨 论

EMs是育龄期女性常见的妇科疾病之一，发病率约10%，病程反复、迁延难愈，是导致痛经、盆腔痛甚至不孕的重要原因[7]。病理生理学研究发现，氧化应激和炎症反应能够促进子宫内膜细胞在腹腔黏附与生长，在EMs的发生发展过程中发挥重要作用[8,9]。

在中医EMs属“痛经”、“癥瘕”、“月经病”、“不孕”等范畴，瘀血阻滞、气血运行不畅是EMs的重要病理机制。大蒜为百合科葱属植物，其鳞茎可入药，性温、味辛甘，大蒜素是其主要活性成分，具有活血化瘀、益气解毒、宣通温补之功效。大鼠具有饲养成本低、动情周期短、自发排卵等特点，移植造模法主要分为自体、同种异体、异种异体移植法，其中自体移植法具有与人体EMs病理特点接近、异位灶种植部位准确等优势。本研究采用自体移植法制备EMs大鼠模型并给予大蒜素进行治疗，结果显示，经大蒜素治疗后EMs大鼠异位病灶明显缩小，粘连评分降低，异位病灶上皮细胞呈现脱落、间质疏松且新生血管明显减少，异位病灶中炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量明显降低，抗氧化酶MPO、SOD、CAT活力明显升高且MDA含量明显降低，提示大蒜素对大鼠EMs具有一定的治疗作用，其机制可能与抑制炎症反应和氧化应激有关。

PI3K/Akt/Nrf2通路是细胞内重要信号转导通路之一，在细胞氧化应激和炎症反应过程中发挥着重要的调控作用。PI3K由脂类和丝氨酸/苏氨酸激酶组成，属脂质激酶家族成员，是细胞内信号转导的第二信使。Akt是PI3K下游信号分子和靶激酶，能够被PI3K诱导磷酸化(p-Akt)而被激活。p-Akt诱导Nrf2与Kelch样ECH关联蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein，Keap1)解离并促进Nrf2核转位，然后与抗氧化响应元件(Antioxidant response element，ARE)结合而诱导抗氧化酶(SOD、CAT等)和HO-1转录表达，进而抑制氧化应激反应和线粒体损伤[10]。NF-κB核转位后能够诱导炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等合成与释放，抑制NF-κB表达则能够明显抑制细胞炎症反应，而HO-1对NF-κB表达与核转位具有抑制作用。本研究发现，经大蒜素治疗能够明显上调EMs大鼠异位病灶p-Akt、Nrf2、HO-1表达并提高Akt磷酸化比率(p-Akt/Akt)，下调NF-κB表达。此外，LY294002是一种具有细胞渗透性的小分子物质，作用于酶的ATP结合位点，是P13K的高效选择性抑制剂，本研究发现，LY294002能够部分逆转大蒜素降低EMs大鼠异位病灶体积和粘连评分、抑制氧化应激和炎症反应、调节PI3K/Akt/Nrf2通路相关蛋白表达的作用。提示大蒜素对大鼠EMs的治疗作用可能与激活PI3K/Akt/Nrf2通路有关。

综上所述，大蒜素对大鼠EMs具有一定的治疗作用，其作用机制可能与激活PI3K/Akt/Nrf2通路，进而抑制炎症反应和氧化应激有关。本研究结果为大蒜素做为EMs治疗提供了理论支持。