TRIP13在非小细胞肺腺癌中促增殖侵袭和血管生成的影响及作用机制

董 岩， 李佳蔚， 贾依娜尔， 黄咏梅， 张 峤

(新疆医科大学附属肿瘤医院， 新疆 乌鲁木齐 830000)

根据2020年世界卫生组织国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)发布的全球癌症数据显示，肺癌是威胁全球人类生命健康的第二大癌症[1]。非小细胞肺癌 (NSCLC)是肺癌的一种，约占所有肺癌病例的85%，其发病率在世界范围内逐年增加[2]。NSCLC包括多种癌症类型，最常见的是肺腺癌 (Lung adenocarcinoma，LUAD)、肺鳞癌 (Lung squamous cell carcinoma，LUSC)[3]。目前的辅助化疗提高了NSCLC患者的生存率，但是它也存在致残或致死的风险[4]。甲状腺激素受体作用因子13(Thyroid hormone receptor interactor 13，TRIP13)在调节有丝分裂过程中起关键作用，包括纺锤体组装检查和DNA修复，这可能是染色体不稳定从而产生癌症的原因[5]。因此TRIP13可能是人类癌症的新治疗靶点。近年来，越来越多的研究发现，TRIP13在多种癌症中过度表达，与癌症的发展密切相关，影响患者的生存率。Agarwal等[6]发现TRIP13能促进结直肠癌肿瘤生长和转移，TRIP13可能是结直肠癌的治疗靶点。Zhou等[7]的研究证明，TRIP13通过调节Notch信号通路促进上皮性卵巢癌发展，而沉默TRIP13可抑制细胞增殖，减少细胞侵袭和迁移，并在体外诱导上皮性卵巢癌细胞凋亡。此外TRIP13能够调节NSCLC细胞增殖、侵袭和细胞周期检查点，可能是临床上诊断和治疗肺癌的有用标志物[8]。但是目前TRIP13与NSCLC之间的相互关系仍需进一步研究，在本实验中，我们收集了肺腺癌与鳞腺癌的患者的肿瘤组织与癌旁组织，并使用两种肿瘤细胞系，评估了TRIP13的表达，并探索了TRIP13可能的致癌机制，为将来研究NSCLC的致病机制和治疗提供参考价值。

1 资料与方法

1.1一般资料：从2018年2月至2020年2月在我院接受切除手术的NSCLC患者中收集了45例肿瘤及其癌旁组织(距肿瘤边缘≥5mm)。手术取材后将样本立即放在冻存管并置于液氮中，随后在-80℃冰箱保存。所有患者手术前未接受放化治疗，患者均签署知情同意书，本研究在我院伦理委员会的监督下获得批准和实施。人肺腺癌细胞系A549和肺鳞癌细胞系SKMES1均购自中国科学院上海研究所细胞库，RPMI1640培养基、多聚甲醛和结晶紫溶液均购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清(FBS)购自浙江天杭生物科技股份有限公司，TRIzol、逆转录试剂盒和SYBR Green试剂购自上海翌圣公司，Transwel购自康宁公司，CCK8试剂购自上海信裕公司，TRIP13抗体、GAPDH抗体购自abcam公司，TRIP13、VEGFA和GAPDH 的qPCR引物由上海生工生物公司合成；过表达TRIP13的慢病毒(PLK-TRIP13)及阴性对照病毒(PLK-NC)由上海汉恒生物科技有限公司构建。

1.2细胞培养：人肺腺癌细胞系A549和肺鳞癌细胞系SKMES1均使用含10%FBS的RPMI 1640培养基，将所有细胞置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中，根据细胞生长密度更换新鲜培养基。当细胞生长融合度达到80%～90%时进行消化传代，选择对数生长期细胞进行下一步实验。

1.3慢病毒转染实验：分别设置为A549组(转染PLK-NC)与A549+PLK-TRIP13组(转染PLK-TRIP13)、SKMES1组(转染PLK-NC)与SKMES1+PLK-TRIP13(转染PLK-TRIP13)。细胞在含10% FBS的培养基中培养，当细胞生长密度达到70%～80%时转染病毒。转染前1d，细胞用0.25%胰蛋白酶消化后接种于24孔板(1×105个细胞/孔)。用阴性对照病毒测定两个细胞的转染条件和感染复数值，根据MOI值计算每孔所需病毒量[病毒体积=(MOI×细胞数)/病毒滴度，病毒滴度=2×108TU/mL]。每孔加入2.5μL聚凝胺(2mg/mL)，然后加入培养基补充体积至500μL/孔。48h后，更换新鲜培养基继续培养。72h 后收集细胞并检测TRIP13过表达的效果。

1.4细胞侵袭实验：A549 细胞和 SKMES1 细胞分别接种在6孔板中，每孔2×104个细胞，加入100μL无血清RPMI 1640培养基悬浮细胞，将6000μL含20%血清的RPMI 1640培养基加入小室，在培养箱中培养48h。移走小室并倾倒培养基，然后在含有多聚甲醛和结晶紫的溶液中连续固定和染色。用棉签擦拭室内的未侵袭的细胞，并在显微镜下拍照。对每个视野中的侵袭细胞进行计数。

1.5CCK8细胞增殖实验：取对数生长期细胞用0.25%胰蛋白酶消化并离心。用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基将细胞稀释成单细胞悬液，接种到96孔板中。细胞浓度调至8000个/孔，置37℃、5%CO2培养箱。在24h、48h和72h时，每孔加入20 μL CCK8溶液，2h后用酶标仪测定450nm处的吸光度(A)值。

1.6qRT-PCR法：TRIzol试剂提取NSCLC及癌旁组织样本、A549和 SKMES1 细胞中的总RNA，酶标仪检测总RNA的纯度和含量。按照qRT-PCR试剂盒实验说明，依次进行逆转录和qRT-PCR实验。qRT-PCR反体系：cDNA模板2ng，上下游引物各0.4μL，SYBR Primix Ex TaqTM 5 μL，ddH2O补充至10μL。qRT-PCR反应条件：95oC(30s)预变性后，变性95oC(7s)，退火55℃(30s)，72℃(15s)，40个循环周期。扩增结果根据2-△△Ct法计算mRNA的相对表达量。qRT-PCR引物序列：CAPDH-F，5-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3，CAPDH-R，5-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3；TRIP13-F，5- TGCATGCACTGTTGCACTTC-3，TRIP13-R，5- GGGTTGCACAAGTATCACGC-3；VEGFA-F，5- GTCCTGGAGCGTGTACGTTG -3,VEGFA-R，5- CTTCCGGGCTCGGTGATTTA-3。

1.7Western blot法：收集各组细胞，RIPA裂解提取总蛋白，BCA法定量蛋白。变性后用SDS-PAGE凝胶电泳分离等量的蛋白质，转移至PVDF膜上。5%脱脂牛奶4℃密封1h，TBST洗膜5min，3次。加入TRIP13-b抗体(1∶2000)，4℃摇床过夜。TBST膜洗涤5min，3次。加入HRP标记的羊抗兔二抗(1∶1000)，37℃孵育1h。TBST膜洗涤5min，5次。蛋白质条带灰度值通过image-Pro Plus Image分析系统进行分析。 实验重复3次，取平均值。

2 结 果

2.1NSCLC 中TRIP13表达量改变与临床病理特征间的关系：通过qRT-PCR分析NSCLC肿瘤和配对的癌旁组织中TRIP13表达水平。结果显示，与癌旁组织相比，NSCLC患者肿瘤组织中TRIP13的表达水平显著升高(1.00±0.34 vs 7.69±2.14,P=0.007)，见图1。

图1 NSCLC肿瘤及癌旁组织中TRIP13表达差异注：与癌旁组织比较，**P<0.01

根据TRIP13相对表达水平(肿瘤组织/癌旁组织)的中位数5.62，将45例患者分为TRIP13低表达组(肿瘤组织/癌旁组织<5.62，n=22)和高表达组(癌旁组织/癌组织≥5.62，n=23),并分析患者TRIP13表达量与临床病理特征间的关系。结果显示，大部分肺腺癌患者相对高表达TRIP13(P<0.05)，而大部分肺鳞癌患者低表达TRIP13(P<0.05)。此外TRIP13的表达水平与NSCLC患者淋巴结转移、肿瘤进展程度相关(P<0.05)，与性别、年龄因素无关(P>0.05)。提示TRIP13可能在肺腺癌中发挥关键作用，影响肿瘤的恶化和转移，见表1。通过Kaplanmeier-plotter数据库进一步分析TRIP13与肺腺癌和肺鳞癌患者相关性，发现TRIP13的表达水平能够影响肺腺癌的预后，而对肺鳞癌的预后没有影响，见图2。

图2 Kaplanmeier-plotter数据库分析TRIP13表达水平与肺癌患者预后的关系

表1 TRIP13表达差异与临床病理特征相关性比较

2.2过表达TRIP13的NSCLC细胞系构建：通过慢病毒将PLK-NC和PLK-TRIP13分别转染至非小细胞肺腺癌A549和非小细胞肺鳞癌SKMES1细胞。采用qRT-PCR和western blot检测各组细胞TRIP13 mRNA和蛋白表达水平。结果显示，A549组细胞的TRIP13 mRNA和蛋白表达水平均高于SKMES1组(1.00±0.24 vs 0.26±0.03,P=0.001；1.00±0.22 vs 0.21±0.05,P=0.006)。与A549组相比，A549+PLK-TRIP13组细胞TRIP13 mRNA和蛋白表达水平提高(1.00±0.24 vs 5.65±0.63,P=0.001；1.00±0.22 vs 1.72±0.21,P=0.004)。与SKMES1组相比，SKMES1+PLK-TRIP13组细胞TRIP13 mRNA和蛋白表达水平提高(0.26±0.03 vs 0.826±0.07,P=0.003；0.21±0.05 vs 0.86±0.03,P=0.001)，见图3。说明过表达TRIP13的NSCLC稳转细胞系构建成功。

图3 过表达TRIP13的NSCLC细胞系鉴定注：与A549组比较，**P<0.01，***P<0.001；与SKMES1组比较，**P<0.01

2.3过表达TRIP13对A549细胞增殖和侵袭的影响：CCK8结果显示，与A549组相比，A549+PLK-TRIP13组细胞增殖能力提高，在72h时表现出显著性差异(1.12±0.27 vs 1.73±0.20,P=0.004)，见图4A。Transwell结果显示，与A549组相比，A549+PLK-TRIP13组细胞侵袭数量增加(214.25±11.64 vs 384.69±23.54,P=0.001)，见图4B。

图4 过表达TRIP13对A549细胞增殖和侵袭的影响注：与A549组比较，**P<0.01，***P<0.001

2.4过表达TRIP13对A549细胞血管生成的影响：采用western blot检测A549细胞血管生成相关蛋白VEGF的表达水平。结果显示，与A549组相比，A549+ PLK-TRIP13组细胞VEGF蛋白表达水平提高(0.51±0.16 vs 0.97±0.15,P=0.006)，见图5。

图5 过表达TRIP13对A549细胞血管生成的影响注：与A549组比较，**P<0.01

2.5过表达TRIP13对SKMES1细胞增殖、侵袭和血管生成的影响：我们探究TRIP13在非小细胞肺鳞癌SKMES1细胞中的作用。CCK8实验结果显示，与SKMES1组相比，SKMES1+PLK-TRIP13组细胞增殖能力没有显著差异(1.52±0.13 vs 1.59±0.14,P=0.482)，见图6A。Western blot实验结果显示，与SKMES1组相比，SKMES1+PLK-TRIP13组细胞VEGF蛋白表达水平略微升高，但无显著性差异(0.78±0.09 vs 0.82±0.15,P=0.672)，见图6B。Transwell实验结果显示，与SKMES1组相比，SKMES1+PLK-TRIP13组细胞侵袭数量增加，有显著性差异(159.85±14.57 vs 174.39±9.50,P=0.032)，见图6C。结果表明过表达TRIP13对非小细胞肺鳞癌的影响较少，仅能轻微促进细胞侵袭和血管生成。

图6 过表达TRIP13对SKMES1细胞增殖、侵袭和血管生成的影响注：与SKMES1组比较，*P<0.05

3 讨 论

肺癌是全球致死率最高的恶性肿瘤，每年有众多患者死于肺癌。到目前为止，针对特定肿瘤中某些分子改变的靶向治疗方法已成功用于肺腺癌，需要更多的研究阐述癌细胞内的分子相互作用，从而实现创新药物设计，指导精确的癌症治疗。

TRIP13是ATPases家族的一个保守的成员，是特定染色体事件的关键调节因子，在减数分裂程序中，它参与控制G2的前期过程，如DNA断裂重组、检查点信号传导等[5]。很多研究表明TRIP13与癌症的发生发展密切相关，该基因定位于细胞膜和细胞质，并在体外和体内均能表现出致癌作用。本实验研究发现，与癌旁组织相比，非小细胞肺腺癌患者肿瘤组织中TRIP13的表达水平显著升高，TRIP13的表达水平能够影响肺腺癌的预后，然而在肺鳞癌患者中，TRIP13的表达水平没有变化，TRIP13对于肺鳞癌患者的预后没有影响，表明的TRIP13可能仅与肺腺癌发展相关，而与肺鳞癌的发病无相关性。

研究证明，TRIP13可以通过控制肿瘤细胞的增殖和迁移来促进癌症发展。例如，TRIP13干扰通过调节TTC5/p53通路和上皮间质转化相关基因表达抑制甲状腺癌细胞的增殖和转移[9]，在结直肠癌向肝脏转移的过程中，肝脏与结直肠中均显示TRIP13过表达，TRIP13敲低会阻碍结直肠癌细胞的集落形成、侵袭、运动和球体形成能力[10]。另外也有研究证实，TRIP13表达与肺癌患者的肿瘤大小和患者的高死亡率呈正相关，TRIP13促进肺腺癌细胞增殖、克隆形成和迁移，同时在体外抑制肺腺癌细胞的凋亡[11]。在本实验研究发现过表达TRIP13的A549肺腺癌细胞侵袭数量显著增加。VEGF是一种参与机体所有血管生成的细胞因子，对内皮细胞具有促有丝分裂和抗凋亡作用，高表达则可以促进血管的通透性和细胞迁移能力[12]，过表达TRIP13的A549肺腺癌细胞的VEGF蛋白表达显著提高，说明过表达TRIP13可能通过促进肺腺癌细胞增殖和侵袭和血管生成参与疾病的发展，但是过表达TRIP13对SKMES1肺鳞癌细胞的影响较少，仅能轻微促进细胞侵袭和血管生成。以上说明TRIP13对非小细胞肺腺癌影响较大，对鳞癌影响较少。

另外，本实验也存在一些不足之处，本实验中仅采取了两种NSCLC细胞来验证TRIP13与肺腺癌与肺鳞癌可能存在的相互关系，因此无法认为所有的肺腺癌患者均与TRIP13基因相关而肺鳞癌患者与TRIP13基因无关，后续需要使用多种NSCLC细胞系进行进一步验证。

综上所述，TRIP13在非小细胞肺腺癌组织和细胞中呈现高表达，TRIP13增加了非小细胞肺腺癌细胞的增殖侵袭和促血管生成作用。以上结果初步明确了，TRIP13在非小细胞肺腺癌发生发展中的作用，可为进一步探讨非小细胞肺腺癌的增殖和转移机制提供新的思路。