乳腺癌组织中miR-4732-5p TSPAN13 mRNA的表达及临床意义

许 帆， 沈 燕， 张 霞

(上海中医药大学附属曙光医院乳腺科， 上海 200093)

乳腺癌指起源于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，是全球女性最常见同时死亡率最高的恶性肿瘤，最新数据显示，乳腺癌发病率和死亡率分别为58.5/10万、17.7/10万[1]。乳腺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，其组织形态、免疫表型、治疗反应等存在极大差异，尽管近年来乳腺癌的治疗取得较大进展，其预后相对较好，但晚期乳腺癌患者5年生存率仍然不足20%[2]。深入研究乳腺癌分子机制，对改善患者预后具有重要意义。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类短链非编码小RNA，在转录后水平介导靶基因的负向调控，参与肿瘤发生发展。miR-4732-5p是新近发现的一种miRNA，研究报道其在乳腺癌组织中高表达，可作为乳腺癌诊断生物标志物[3]。四跨膜蛋白13(tetraspanin 13，TSPAN13)是TSPAN超家族一员，参与细胞增殖、分化、迁移等一系列生物过程，研究报道TSPAN13在乳腺癌细胞株中呈低表达，能抑制乳腺癌增殖、分化、迁移等行为[4]。但关于乳腺癌组织中miR-4732-5p、TSPAN13 mRNA表达与临床病理特征和预后的关系尚不明确，基于此本研究报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料:收集2016年1月至2018年8月于我院住院的105例乳腺癌患者手术标本，包括癌组织和距离>5cm的癌旁组织，新鲜组织获取后立即分装于冻存管中置放入液氮保存。年龄32～78(50.25±5.68)岁；肿瘤部位：49例左侧，56例右侧；肿瘤直径：49例≥4cm，56例<4cm；病理类型：45例浸润性癌，60例非浸润性癌；雌激素受体：76例阳性，29例阴性；孕激素受体：60例阳性，45例阴性；分化程度：43例低分化，62例中高分化；TNM分期：51例Ⅰ～Ⅱ期，54例Ⅲ～Ⅳ期；淋巴结转移：49例转移，56例无转移。纳入标准：①经术后病理检查确诊为宫颈癌；②初诊，未接受任何抗肿瘤治疗；③女性；④病理资料和随访资料完整；⑤患者及家属均知情研究。排除标准：①合并其他部位肿瘤；②年龄<18岁；③严重心、肝、肾等脏器疾病者；④全身感染性疾病者。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2方法:取出液氮冻存组织，转至无RNase的EP管，每30～50mg组织加入1mL Trizol裂解，提取组织总RNA，BioPhotometer plus 核酸蛋白测定仪测定总DNA浓度及纯度，使OD260/OD280为1.8～2.0，Takara试剂盒反转录合成cDNA，使用qRT-PCR试剂盒进行qRT-PCR扩增。miR-4732-5p上游引物：5′-GATCTGGATTGATATCAT-3′，下游引物：5′-TTCGAATGAGGACTAATA-3′；TSPAN13上游引物：5′-AACGCTGGCTCCGAAAACTT-3′，下游引物：5′-CCTAAGGCGGTAAAATGCC-3′；miR-4732-5p内参U6上游引物：5′-TTACTGATTCGCTAGCAT-3′，下游引物：5′-CCGATTCTACGCTCGTGA-3′；TSPAN13内参GAPDH上游引物：5′-GGCTACAGCAACAGGGTG-3′，下游引物：5′-TTTGGTTGAGCACAGGGT-3′。反应体积共20μL：10μL 2×All-in-One qPCR Mix；2μL上游、下游引物；2μL cDNA模板；4μL经DEPC处理水。反应条件：95℃预变性10min循环1次，95℃变性10s、60℃退火20s、延伸72℃ 10s循环40次，反应结束后得到各反应管Ct，构建溶解曲线，采用2-ΔΔCt法计算组织中miR-4732-5p、TSPAN13 mRNA相对表达量。

1.3随访:患者出院后通过门诊或电话方式随访3年，随访至2021年8月，统计术后3年累积生存率，累积生存率定义为治疗后至任何原因死亡或随访截止。

2 结 果

2.1乳腺癌组织与癌旁组织中miR-4732-5p、TSPAN13 mRNA表达比较:乳腺癌组织中miR-4732-5p表达(1.131±0.273)高于癌旁组织(0.629±0.169)，TSPAN13 mRNA表达(0.355±0.078)低于癌旁组织(0.529±0.081)，差异具有统计学意义(t=16.019、-15.790，P均<0.001)。

2.2乳腺癌组织中miR-4732-5p与TSPAN13 mRNA表达的相关性:生物学软件TargetScan Release 7.2预测发现，TSPAN13与miR-4732-5p存在结合位点，Pearson相关性分析显示，乳腺癌组织中miR-4732-5p与TSPAN13 mRNA表达呈负相关(r=-0.732，P<0.001)。见图1和图2。

图1 miR-4732-5p与TSPAN13结合位点示意图

图2 乳腺癌组织中miR-4732-5p与TSPAN13 mRNA表达的相关性

2.3乳腺癌组织中miR-4732-5p、TSPAN13 mRNA表达与临床病理特征的相关性ER阳性:miR-4732-5p、TSPAN13 mRNA表达与乳腺癌分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)，与年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、病理类型、雌激素受体、孕激素受体无关(P>0.05)。见表1。

表1 乳腺癌组织中miR-4732-5p TSPAN13 mRNA表达与临床病理特征的相关性±s)

2.4miR-4732-5p、TSPAN13 mRNA表达与乳腺癌患者生存率的关系:中位随访28个月，105例乳腺癌患者累积生存率为87.62%(92/105)，以miR-4732-5p、TSPAN13 mRNA表达均值为基准分为高低表达组。高miR-4732-5p表达组(≥1.131，n=54)和低miR-4732-5p表达组(<1.131，n=51)累积生存率分别为81.48%(44/54)、94.12%(48/51)，高TSPAN13 mRNA表达组(≥0.355，n=57)和低TSPAN13 mRNA表达组(<0.355，n=48)累积生存率分别为92.98%(53/57)、81.25%(39/48)。高miR-4732-5p表达组累积生存率低于低miR-4732-5p表达组，高TSPAN13 mRNA表达组累积生存率高于低TSPAN13 mRNA表达组(Log-rank χ2=4.700、3.961，P=0.030、0.047)。见图3。

图3 不同miR-4732-5p、TSPAN13 mRNA表达乳腺癌患者K-M生存曲线

2.5乳腺癌患者预后不良影响因素的单因素及多因素Cox回归分析:以随访时间为时间变量，单因素分析有差异因素为自变量，预后(死亡=1，存活=0)为因变量，多因素Cox回归分析显示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移、miR-4732-5p≥1.131为乳腺癌患者预后不良独立风险因素，TSPAN13 mRNA≥0.355为独立保护因素(P<0.05)。见表2和表3。

表2 乳腺癌患者预后不良影响因素的单因素分析

表3 乳腺癌患者预后不良影响因素的多因素Cox回归分析

3 讨 论

乳腺癌主要由乳腺上皮细胞增殖失控进而恶变形成，近年来分子生物学发展为肿瘤治疗提供了新的途径，但乳腺癌在基因水平上的治疗仍然缺乏有力证据，特别是三阴性晚期乳腺癌，抗人表皮生长因子受体2治疗后总体生存率仍然未获得明显改善，进一步探索乳腺癌增殖、转移、复发相关机制，对延长乳腺癌患者生存时间意义重大[5]。

miRNA是一类内源性长约18～25个核苷酸的非编码单链小分子RNA，主要通过降解靶mRNA或阻碍靶蛋白翻译而调控靶基因表达，参与细胞增殖、凋亡、发育、分化、迁移等多种生物学过程。miR-4732-5p是一种新近发现的miRNA，近期几项研究报道miR-4732-5p与人类肿瘤的关系，如miR-4758-3p在胃癌组织和卵巢癌患者血清中高表达，分别与胃癌辅助化疗后复发和卵巢癌发生有关[6,7]。本研究结果显示，乳腺癌组织中miR-4732-5p表达升高，且与患者分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关，说明miR-4732-5p表达升高参与乳腺癌恶性进展，其机制可能与miR-4732-5p能下调p53有关。p53是一种肿瘤抑制基因，能阻止DNA突变或受损细胞分裂并通过转录调控细胞传导凋亡信号，阻止肿瘤形成[8]。Pouladi等[9]研究显示，miR-4732-5p能通过阻断WD40编码的p53 RNA反义转录子/p53混合物形成下调p53浓度。

TSPAN超家族是一组分子量为20～50kDa的糖蛋白，其四次跨膜结构能联系膜内、跨膜和膜外蛋白，连接膜内外信号通道功能，并促进信号网络中结合蛋白质的相互作用，参与细胞多种生命活动[10]。Li等[11]研究显示，TSPAN13 在甲状腺癌中表达上调，其高表达能促进甲状腺癌细胞增殖和抑制凋亡。Jaiswal等[12]研究报道，TSPAN13在骨肉瘤中表达上调，其高表达能促进骨肉瘤上皮-间质转化和抑制凋亡。本研究结果显示，乳腺癌组织中TSPAN13 mRNA表达降低，且与患者分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关，提示TSPAN13在乳腺癌中发挥抑癌基因作用。本研究结果还显示，miR-4732-5p高表达与TSPAN13 mRNA低表达乳腺癌患者3年累积生存率明显降低，二者均为乳腺癌患者预后不良独立影响因素，说明miR-4732-5p和TSPAN13可成为评估乳腺癌预后的标志物。生物学软件预测发现，TSPAN13的3’-非翻译区域含有miR-4732-5p的结合位点，相关性分析也证实乳腺癌组织中miR-4732-5p与TSPAN13 mRNA表达呈负相关，说明二者可能共同参与乳腺癌发生发展。Wang等[13]通过荧光素酶报告基因证实，miR-4732-5p能靶向下调TSPAN13促进乳腺癌增殖、迁移和侵袭。

综上所述，乳腺癌组织中miR-4732-5p表达上调，TSPAN13 mRNA表达下调，与分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关，可能成为乳腺癌患者预后评估生物标志物。但本研究样本量较少，随访时间较短，关于miR-4732-5p、TSPAN13参与乳腺癌的机制还需进一步研究。