七氟醚基于BDNF/TrkB信号通路对孕晚期大鼠子代树突棘发育的影响

苏 娟， 张振忠， 张友佳

(1.新疆医科大学第二附属医院麻醉科， 新疆 乌鲁木齐 830000 2.新疆医科大学第七附属医院麻醉科， 新疆 乌鲁木齐 830000)

随着外科手术的发展，孕期手术的适应症增加，妊娠期接受外科手术的孕妇逐渐增多。七氟醚作为常用的吸入型麻醉剂，具有对呼吸道刺激小，血流动力学稳定，麻醉/苏醒较快的优势，在妇产科广泛应用。然而，对于孕期妇女，七氟醚也会迅速通过胎盘到达胎儿体内，当胎儿反复或者长时间暴露于全麻药物会造成神经毒性[1]。2016年美国FDA也有指出，孕晚期重复或长时间(小于3h)暴露于全麻药物可能会影响胎儿的大脑发育，造成儿童远期的学习和记忆能力降低。然而，目前关于孕晚期母体暴露于七氟醚对子代大脑发育的影响研究较少，且机制仍待探索。对大鼠而言，七氟醚最低肺泡有效浓度值约为2.3%[2]，因此，本研究拟采用2.3%七氟醚麻醉孕晚期大鼠，观察其对子鼠远期大脑树突棘发育和认知功能的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物:8只SD大鼠，由新疆医科大学实验动物中心提供。雌性，清洁级，3～4月龄，怀孕15～16d大鼠，体质量400～450g。分为对照组，七氟醚-1h组，七氟醚-3h组与七氟醚-6h组，每组2只。所有大鼠单笼饲养于22～24℃动物房中，自由进食、饮水，空气流通且正常昼夜更替。

1.2材料与仪器:七氟醚(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；人工脑脊液(ACSF，上海碧云天生物科技有限公司)；高尔基染色试剂盒(美国HitoBiotec公司)；Anti-PSD-95抗体、Anti-BDNF抗体、Anti-β-actin抗体(武汉三鹰生物科技有限公司)；Anti-p-TrkB抗体、Anti-TrkB抗体(北京博鳌森生物科技有限公司)；HRP标记IgG(H+L)二抗(上海碧云天生物科技有限公司)；Morris水迷宫测试装置(江苏赛昂斯生物科技有限公司，型号：SA201)；显微镜(日本Olympus公司，型号：BX53)；激光扫描共聚焦显微镜(美国Thermo公司，型号：CX7 LZR Pro)；凝胶成像显影仪(上海天能生物技术，型号：1600/1600R)。

1.3实验方案:将孕晚期(19～21d)大鼠以2.3%七氟醚分别麻醉1h，3h与6h。所有大鼠单独饲养，待幼鼠出生后31d(P31)，每组取12只P31幼鼠开展水迷宫训练，第35d进行水迷宫实验并以高浓度CO2处死，分离出全脑组织或海马组织开展长时程电位测试、高尔基体染色与Western blot检验。

1.4Morris水迷宫实验:水迷宫测试分为训练期与测试期。训练期将幼鼠自水迷宫各个象限依次投入水中，记录幼鼠90s内寻找并登上逃生平台时间，每天训练4次，取平均时间记为逃避潜伏期，共4d。第5天进入测试期，撤去逃生平台，将幼鼠自第I象限投入水中，记录幼鼠首次到达平台时间，穿越平台次数和第Ⅲ象限停留时间。

1.5电生理测试:将P35幼鼠以CO2处死，取脑组织放入预冷的ACSF中，沿矢状线切开大脑左右半球，固定于切片机，纵向切成约350μm厚的切片，转移至ACSF中，30℃恒温孵育2h。自海马Schaffer侧支处插入刺激电极，在海马锥体神经元CA1顶树突区域插入记录电极，充灌ACSF作为记录电极内液。采用细胞外场电位模式刺激，不断调整刺激强度和记录电极的位置、深度，用0.05Hz的刺激频率诱发场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)，直到记录出典型的场电位波形。调节刺激强度至最大响应，并以50%作为基线，固定刺激强度与记录电极。在基线稳定记录20min后，应用高频刺激诱发长时程增强(long term potentiation,LTP)，连续3串高频脉冲，每串100Hz的100次刺激，连续记录60min。统计诱导前后Slope并进行标准化计算，对长时程电位(Long-term potentiation,LTP)进行量化统计。

1.6高尔基体染色—树突棘状态评估:将P35幼鼠以CO2处死，取完整脑组织浸入预配置的溶液A、溶液B混合液，避光保存2周。转移脑组织至溶液C中，避光保存3d。将脑组织放入预冷的异戊烷中冷冻，切成100μm厚切片。蒸馏水清洗切片后置入溶液D、溶液E混合液中反应10min，蒸馏水冲洗。将切片放在梯度酒精中脱水，再经二甲苯I与二甲苯Ⅱ透化，最后用树脂封片。激光扫描共聚焦显微镜下捕获图像，用Image J软件统计树突棘密度和长度(文中溶液A,B,C,D,E来自于高尔基染色试剂盒)。

1.7Western blot:将P35幼鼠以CO2处死，取海马组织，加入RIPA裂解液研磨成单细胞悬液，静置20min使蛋白完全裂解，离心后取上清，加入上样缓冲液后沸水浴10min。取SDS-PAGE凝胶，每孔加入约10μg样品与预染蛋白Marker。设置电泳条件：60V/30min，120V/60min，以上样缓冲液到达凝胶底部为电泳终点。截取目标蛋白条带，湿法转膜法将凝胶上蛋白转移至PVDF膜上，设置转膜条件：2mA/60min，以上所有过程冰水浴。取出PVDF膜，以4%胎牛血清封闭，目的蛋白一抗稀释液孵育PVDF膜，4℃过夜。次日，取出PVDF膜，用HRP标记IgG(H+L)二抗稀释液孵育2h。将超敏发光液滴加在PVDF膜上，显影获得目的蛋白条带。

2 结 果

2.1不同浓度七氟醚对子代大鼠学习与记忆能力的影响:随着七氟醚麻醉时间增加，P35幼鼠的逃避潜伏期，首次到达平台时间增加，而第Ⅲ象限停留时间占比与穿越平台次数减少。见表1、表2。

表1 训练期间P35幼鼠逃避潜伏期±s,n=8)

表2 测试期间P35幼鼠首次到达平台时间、第Ⅲ象限停留时间与穿越平台次数±s,n=8)

2.2不同浓度七氟醚对子代大鼠长时程电位的影响:与对照组相比，七氟醚-1h组P35幼鼠海马CA1区fEPSP没有明显改变，但七氟醚-3h与七氟醚-6h组P35幼鼠fEPSP水平明显降低(P<0.05)，即fEPSP斜率与七氟醚麻醉时间正相关。见图1。

图1 各组P35幼鼠fEPSP斜率量化统计与对照组相比，#P<0.05与对照组相比，#P<0.05

2.3不同浓度七氟醚对子代大鼠树突棘发育的影响:与对照组相比，七氟醚-1h组P35幼鼠海马CA1区树突棘密度与长度没有明显改变，但七氟醚-3h与七氟醚-6h组P35幼鼠树突棘密度与长度明显降低(P<0.05)。见图2。

图2 各组P35幼鼠树突棘发育状态与量化统计与对照组相比，#P<0.05

2.4不同浓度七氟醚对PSD-95/BDNF/TrkB蛋白表达的影响:与对照组相比，七氟醚-1h组P35幼鼠海马区中PSD-95、BDNF与p-TrkB蛋白表达没有明显改变，但七氟醚-3h与七氟醚-6h组P35幼鼠海马区中PSD-95、BDNF与p-TrkB蛋白表达明显降低(P<0.05)。见图3。

图3 各组P35幼鼠PSD-95，BDNF与TrkB表达与量化统计与对照组相比，#P<0.05

3 讨 论

以往对全麻药物的研究显示，胎儿或者儿童长时间或多次开展全麻手术可使幼龄动物海马神经元中凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3与Bax的表达增加，使神经元中抗凋亡蛋白含量升高，引发神经元凋亡[3]，造成幼鼠学习与记忆能力损伤。本研究水迷宫结果中，孕晚期大鼠短期七氟醚吸入麻醉(麻醉时间≤1h)对子代P35幼鼠逃避潜伏期，穿越平台次数和第Ⅲ象限停留时间没有影响，即学习与记忆功能没有改变，但孕晚期大鼠长期麻醉(麻醉时间≥3h)会导致P35认知功能损伤。因此，七氟醚麻醉对子代幼鼠的影响具有剂量依赖性。综合该部分结果可以得出，对于孕晚期患者，全身麻醉并非完全禁忌行为，短期的七氟醚麻醉对其子代认知功能影响甚微，但由于本研究七氟醚麻醉跨越时间较广，因此麻醉时间的选择仍待继续探索。

学习与记忆功能障碍是突触可塑性损伤的宏观表现。突触可塑性是指突触间信号传递效能，树突棘是突触的基本结构[4]。哺乳动物中枢神经系统中，树突棘负责接收来自兴奋性信号输入，并以突触结构向下传递。因此，树突棘是大脑神经回路发育、完善和维持的关键，是记忆的形成和储存神经生物学基础[5]。阿尔兹海默病模型大鼠中，存在明显的Aβ沉积与Tau蛋白缠结的同时也可观察到明显的树突棘萎缩现象[6]。术后认知功能障碍的研究中也有表示NMDA受体介导的兴奋性传递抑制往往也与树突棘萎缩相关[7]。且水迷宫实验结果较好的健康大鼠中也有显示树突棘密度明显更高[8]。在树突棘之间以突触结构传递信号时，突触前神经元去极化，引发谷氨酸递质释放、激活突触后NMDA受体，介导Ca2+内流，诱发突触后电位幅度明显增加，产生LTP[9]。因此，LTP在某一程度上也反映了学习与记忆能力。本研究结果显示，孕晚期大鼠短期七氟醚吸入麻醉(麻醉时间≤1h)对子代P35幼鼠海马体中树突棘密度与LTP水平没有影响，但孕晚期大鼠长期麻醉(麻醉时间≥3h)则导致幼鼠海马体中树突棘密度与LTP水平明显降低，即七氟醚对孕晚期大鼠长期麻醉会导致幼鼠大脑发育受损。

大脑空间学习与记忆功能的执行部位是海马区域组织，该区域神经元和树突棘结构的破坏以及数量的减少，均可造成记忆和认知功能障碍[10]。PSD-95是突触后致密物的主要成分，反映了树突棘数量并维持突触间的功能与形态，利于信息传递和记忆形成。研究中，阿尔兹海默病的发展过程中，PSD-95会出现连续性降低[11]。本研究中，长期七氟醚麻醉介导孕晚期大鼠子代幼鼠海马区PSD-95表达降低，反映了树突棘发育受损。BDNF作为分布于海马和皮质部位的主要神经营养因子，主要负责神经元发育与调节树突棘的生长功能。BDNF可与其高亲和力受体TrkB结合，促使酪氨酸激酶发生磷酸化，触发胞内信号转导，提高突触间联系，参与LTP的形成。此外，TrkB的激活也被发现可以促进突触前受体信号途径中谷氨酸的释放，促进树突内PSD-95蛋白表达增加，刺激神经元树突棘的生长于分化。本研究中结果显示，长期的七氟醚麻醉介导子代幼鼠海马区BDNF表达水平明显降低，且p-TrkB表达明显降低，然而短期的七氟醚麻醉对BDNF与p-TrkB几乎没有影响。

综上所述，我们认为孕晚期大鼠长期麻醉后幼鼠的学习与记忆能力降低是由神经元生长营养因子BDNF表达减少引起。其原因是介导p-TrkB表达降低介导PSD-95蛋白减少，导致树突棘发育受损。