酸枣仁皂苷A对U251细胞凋亡的影响

陈 霖 ， 陈泉瑛 ， 杜 园 ， 晋坤龙 ， 易小伟 ， 李 妍

(1. 吉林医药学院药学院 ， 吉林 吉林 132013 ； 2. 吉林医药学院基础医学院 ， 吉林 吉林 132013)

神经胶质瘤(Glioma)简称胶质瘤，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，具有高侵袭性、易复发、高死亡率等特点[1]。临床上胶质瘤以手术治疗为主，并辅以放疗、化疗及免疫治疗。胶质瘤手术全切率低，肿瘤易复发，且预后性差，故成为严重影响人类健康的肿瘤之一[2]。由于化疗药物毒副作用较多，且易产生耐药性，因此天然药物活性成分对抗胶质瘤的作用研究成为近年来的研究热点[3-5]。

酸枣仁皂苷A(Jujuboside A，JuA)是酸枣仁的主要活性成分。近年来，多项研究结果显示，JuA具有广泛的药理作用。除传统的宁心安神、镇静催眠作用外，JuA还具有抗氧化、保护心肌细胞、抗缺氧和抗肿瘤等多种药理作用[6-7]。在以往的试验中，本课题组发现一定浓度的JuA对胶质瘤U251细胞增殖具有明显的抑制作用，且呈剂量依赖效应。本试验在前期研究的基础上，进一步探讨了JuA抑制胶质瘤U251细胞增殖的相关机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系 神经胶质瘤细胞U251来自中国科学院上海生命科学研究院。

1.2 仪器与试剂 MCO-18AIC细胞培养箱(北京东方安若生化科技有限公司产品)；DL-CJ-IN超净台(苏州净化仪器厂生产)；MuseTM细胞分析仪(德国默克-密理博生物科技有限公司产品)；IX-70型倒置显微镜(日本奥林巴斯有限公司产品)。JuA(≥98%，北京索莱宝科技有限公司)；胎牛血清(元亨生物科技有限公司)；1640培养基(美国Hyclone公司)；AO/EB染料、胰蛋白酶(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品)。

1.3 细胞培养 U251细胞于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100U/mL 链霉素的1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养。

1.4 JuA的药物配制 准确称取JuA粉末溶于DMSO，配置成33.33 mmol/L的JuA储存液，滤器过滤除菌后-20 ℃保存。JuA储存液与1640培养基稀释成终浓度分别为10、30 μmol/L和50 μmol/L的JuA工作液。

1.5 MuseTM细胞分析仪检测细胞凋亡水平 取对数生长期U251细胞，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养。待细胞贴壁后，以终浓度为0(空白对照组)、10、30 μmol/L和50 μmol/L的JuA干预，继续培养24 h。0.25%的胰蛋白酶消化，1.5 mL EP管中每管加入100 μL细胞及100 μL Annexin V 试剂，轻微震荡混匀。室温避光孵育20 min，使用MuseTM细胞分析仪进行检测。

1.6 Hochest 33258染色观察U251细胞核改变 取对数生长期U251细胞，胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，接种于24孔板中，放入37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养。待细胞贴壁后，加入终浓度分别为0(空白对照组)、10、30 μmol/L和50 μmol/L的JuA干预，继续培养24 h。4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗2遍。各组细胞滴加Hoechst 33258染色液避光染色5 min，PBS清洗2遍，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.7 AO/EB染色观察U251细胞凋亡 取处于对数生长期U251细胞，接种于无菌24孔板中，在37 ℃、5% CO2培养箱中进行常规培养。细胞贴壁后，加入终浓度分别为0(空白对照组)、10、30 μmol/L和50 μmol/L的JuA进行干预，培养24 h，4%多聚甲醛固定10 min。各组加入AO/EB染色液避光染色5 min，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

2 结果

2.1 MuseTM细胞分析仪检测 如图1所示，与空白对照组相比，经10、30 μmol/L和50 μmol/L JuA干预24 h，U251细胞凋亡数目增多，且随着JuA干预浓度的增加，凋亡细胞逐渐增多，细胞晚期凋亡数目变化更为明显。细胞凋亡趋势具有剂量相关性，随着药物浓度的增加，凋亡细胞总数逐渐增加(P<0.01)，见图2。

图1 MuseTM细胞分析仪检测JuA 对U251细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of JuA on apoptosis of U251 cells as detected by MuseTM cell analyzer A：空白对照组； B：10 μmol/L JuA组； C：30 μmol/L JuA组； D：50 μmol/L JuA组A：Blank control group; B：10 μmol/L JuA group; C：30 μmol/L JuA group; D：50 μmol/L JuA group

图2 不同浓度的JuA对U251细胞晚期细胞凋亡率的影响Fig.2 Effects of different concentrations of JuA on the late apoptosis rate of U251 cells **：与空白对照组相比，P<0.01；下同**：Compared with the blank control group,P<0.01. The same as below

2.2 Hochest 33258染色观察 如图3所示，空白对照组细胞核荧光染色均匀，呈淡蓝色荧光，细胞核较大。与空白对照组相比，经不同浓度的JuA干预后，Hoechst 33258 染色阳性细胞数均增加，细胞核致密浓染，呈亮蓝色荧光，且细胞核变小浓集，细胞染色质固缩、凝集。细胞核碎片化和边缘化等典型凋亡细胞形态随药物浓度增加而变化显著。

图3 Hoechst 33258染色检测JuA对U251细胞凋亡的影响(200×)Fig.3 Effect of JuA induced apoptosis in U251 cells as revealed by hoechst 33258 staining (200×)A：空白对照组； B：10 μmol/L JuA组； C：30 μmol/L JuA组； D：50 μmol/L JuA组A：Blank control group; B：10 μmol/L JuA group; C：30 μmol/L JuA group; D：50 μmol/L JuA group

2.3 AO/EB双染观察各组细胞凋亡水平 如图4所示，空白对照组绝大多数细胞核呈现圆形或者椭圆形的亮绿色荧光。与空白对照组相比，不同浓度JuA干预后，橙红色细胞核所占比例明显增大。与空白对照组比较，JuA干预组细胞核形状差异较大，橙红色细胞核斑块、碎片较多。且随着药物浓度的增加，上述改变越加明显(P<0.01)，见图5。

图4 AO/EB染色检测JuA对U251细胞凋亡的影响(200×)Fig.4 Effect of JuA induced apoptosis in U251 cells as revealed by AO/EB staining (200×)A：空白对照组； B：10 μmol/L JuA组； C：30 μmol/L JuA组； D：50 μmol/L JuA组A：Blank control group; B：10 μmol/L JuA group; C：30 μmol/L JuA group; D：50 μmol/L JuA group

图5 不同浓度的JuA对U251细胞凋亡率的影响Fig.5 Effects of different concentrations of JuA on apoptosis rate of U251 cells

3 讨论

1978年，日本学者Otsuka 等从酸枣仁中分离得到JuA[8]，JuA属于四环三萜类皂苷，是酸枣仁中含量最高的一种皂苷类成分[9]。近年来，对JuA药理作用及相关机制的研究逐渐增多。研究表明，JuA可在体外引起肺癌细胞的凋亡，进一步的研究发现，JuA能够通过直接作用于细胞膜表面的Fat 4蛋白，进而活化HIPPO通路，降低下游靶点蛋白YAP的表达，下调肿瘤增殖和抗凋亡基因的表达，从而导致细胞凋亡[10]。但JuA在中枢神经系统恶性肿瘤中的作用未见报道。本课题组前期试验证实，JuA可抑制人神经胶质瘤U251细胞的增殖，提示JuA可能在恶性神经胶质瘤的治疗中发挥潜在的作用。

细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是一种自然现象，存在于多细胞生物的生长、发育和死亡等过程中。细胞通过启动凋亡程序，能够及时清除机体内的损伤或突变细胞，以维持组织器官和内环境的稳态[11]。细胞凋亡过程不可逆转，凋亡发生时，细胞形态变化主要表现为细胞皱缩、染色质凝固、DNA断裂、凋亡小体形成等，而分子水平则涉及诸多信号转导通路的改变[12]。肿瘤细胞的特征之一是缺乏程序性的细胞死亡过程。Hickman等于1992年首次提出可以将诱导肿瘤细胞凋亡作为肿瘤治疗研究的主要目标和手段[13]。随后诱导肿瘤细胞凋亡成为肿瘤治疗研究的新方向。

本试验首先通过MuseTM细胞分析仪检测，确定了JuA预处理可引起U251胶质瘤凋亡细胞数增加，并证实JuA引起的U251胶质瘤细胞凋亡具有浓度依赖效应，即JuA浓度越高，对U251胶质瘤细胞的凋亡诱导作用越明显；进一步观察发现，JuA可引起U251胶质瘤细胞的形态学改变；Hoechest 33258和AO/EB染色结果均显示，JuA处理的U251胶质瘤细胞细胞核发生凝固、浓缩、边集和碎片化等典型细胞凋亡改变。上述试验结果均提示，JuA抑制U251细胞增殖的机制可能是通过促进细胞凋亡而实现的，但是，JuA引起U251细胞凋亡的具体分子机制有待进一步深入研究。