重点区域规模化牧场牛奶源大肠杆菌耐药性研究

刘欣彤 ， 陈孝杰 ， 王玉凤 ， 邓 翠 ， 于志亚 ， 张向阳 ， 张志博 ，刘义明 ， 徐 飞 ， 李 存 ， 李秀波

(1.天津农学院动物科学与动物医学学院 ， 天津 西青 300384 ； 2. 中国农业科学院饲料研究所 ，国家饲料中药物基准实验室 ， 北京 海淀 100081 ； 3. 新乡学院生命科学技术学院 ， 河南 新乡 453000 ；4. 东北农业大学动物医学院 ， 黑龙江 哈尔滨 150030)

奶牛乳房炎(Bovine mastitis)是由多种病原微生物侵入泌乳奶牛乳腺组织所引发的一种持续性炎症反应，是泌乳奶牛最常见的疾病，也是造成奶牛畜牧养殖业和奶牛乳品生产业损失最严重的疾病[1]。该病流行于世界各地，发病率高且防治困难。引起奶牛乳房炎的微生物种类有很多，如细菌、真菌、病毒、支原体等，以细菌感染较常见，主要包含大肠埃希菌、葡萄球菌、链球菌和沙门菌等[2]。当奶牛患有乳房炎时，其产奶量及乳制品质量均会显著降低，不仅影响奶牛的健康，还会降低养殖效益并增加奶牛治疗成本，甚至会由于抗生素滥用催生多重耐药超级细菌[3]。

大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)又称大肠埃希菌，广泛存在于环境中，虽然大部分大肠杆菌为动物肠道的正常寄生菌之一，但也有一小部分为重要的条件性致病菌，是奶牛乳房炎的细菌检测中重要的环境病原菌[4-5]。20世纪中期，有学者认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对婴儿和幼畜(禽)有致病性，常引起严重腹泻、肾炎、败血症等，导致畜禽生长发育缓慢，生产能力下降，甚至死亡，给畜牧养殖业带来严重的经济损失[6-7]。

本研究对全国重点区域规模化奶牛养殖场健康奶样和临床乳房炎奶样进行细菌学分离，并对牛奶源大肠杆菌分离株进行体外药物敏感性试验，以了解牛奶源大肠杆菌的分离率和药物敏感性，提高药物治疗效率，避免同种药物多次使用造成的耐药性，为兽医临床合理有效地使用抗菌药物提供临床参考数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 标准菌株 大肠杆菌标准菌株ATCC25922，购自广东省微生物所(广东环凯微生物科技有限公司)。

1.1.2 主要试剂与培养基 乙二胺四乙酸(EDTA)、二甲基甲酰胺(DMF)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硼酸、冰醋酸、无水乙醇、丙三醇，均购自国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠，购自北京化工厂；Tris Base，购自北京索莱宝科技有限公司；脑心浸液肉汤(BHI broth)、MH肉汤(MH broth)、LB肉汤(LB broth)、伊红美蓝琼脂培养基(EMB)、麦康凯琼脂培养基(Macconkey agar)、水解酪蛋白琼脂(MH agar)、LB琼脂(Luria-Bertani agar)，均购自青岛海博生物技术有限公司。

1.1.3 抗菌药物 氨苄西林(Ampicillin，AMP)、头孢他啶(Ceftazidime，CAZ)、头孢曲松(Ceftriaxone，CRO)、头孢噻肟(Cefotaxime，CTX)、头孢西丁(Cefoxitin，FOX)、阿米卡星(Amikacin，AMK)、安普霉素(Apramycin，APR)、庆大霉素(Gentamycin，GEN)、新霉素(Neomycin，NEO)、链霉素(Streptomycin，STR)、多西环素(Doxycycline，DOX)、氯霉素(Chloramphenicol，CHL)、氟甲砜霉素(Florfenicol，FFC)、多黏菌素E(Colistin，CL)、亚胺培南(Imipenem，IMP)、美罗培南(Meropenem，MEM)、环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、恩诺沙星(Enrofloxacin，ENR)，均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.4 试验仪器 超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；TC-96/G/H(b)C型PCR仪，杭州博日科技有限公司产品；SQ810C型立式高压灭菌锅，厦门和谱仪器有限公司产品；DHP-9162型电热恒温培养箱，北京利康达圣科技有限公司产品；ZWYR-D2403型恒温振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司产品；台式高速离心机，德国Eppendorf公司产品；DK-8D三孔电热恒温水浴锅，上海岛韩实业有限公司产品；电子分析天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司产品；电子天平YP202N，菁海仪器(上海)有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集 2017—2018年，从全国11个奶牛重点养殖区域的52个规模化牧场共采集牛奶样本2 309份。依照GB 4789.1—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则》进行样本采集。采集完成后，低温条件下运送至实验室。

1.2.2 菌株分离 将牛奶样本接种于脑心浸液肉汤，37 ℃恒温增菌，过夜培养16～24 h后用接种环挑取培养物划线接种于伊红美蓝琼脂平板，置于37 ℃恒温培养箱过夜培养16～24 h，然后挑取伊红美蓝琼脂上黑紫色、圆形、隆起、光滑且对光观察具有金属光泽的单个疑似大肠杆菌菌落，于伊红美蓝培养基上进行纯化培养，将纯化的大肠杆菌于LB琼脂培养基上涂板增菌，保存于30%甘油肉汤中，-80 ℃备用。

1.2.3 药敏试验 严格按照美国临床和实验室标准协会(Clinicai and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐的细菌药物敏感性试验纸片法与稀释法执行标准。采用琼脂稀释法对牛奶源大肠杆菌进行抗微生物的药物敏感性试验。

2 结果

2.1 菌株分离 从2 309份牛奶样品中分离出687株大肠杆菌，总分离率为29.75%。分离纯化菌株在伊红美蓝琼脂培养基上的生长培养特性、菌体形态、菌落特征及革兰染色和生化鉴定特性均符合大肠杆菌的特征；同时采用16S rRNA PCR进行分子生物学辅助鉴定。其中2017年从17个牧场的811份牛奶样本中分离鉴定到252株大肠杆菌，分离率为31.07%；2018年从35个牧场的1 498份牛奶样本中分离鉴定出435株大肠杆菌，分离率为29.04%。京津冀鲁区域牛奶中大肠杆菌的分离率为18.60%～34.86%，其中北京地区分离率最高，其次是天津地区及河北地区，山东地区分离率最低；东北地区分离率相似(辽宁地区24.55%、吉林地区24.14%)；上海、贵阳等其他地区分离率差异较大，贵阳地区最高(52.99%)，上海地区最低(9.29%)。2017—2018年全国重点区域规模化牧场牛奶源大肠杆菌分离率见图1。

图1 2017—2018年重点区域规模化牧场牛奶源大肠杆菌分离率Fig.1 Prevalence of E.coli in milk samples collected during 2017—20181：北京; 2：天津; 3：河北; 4：山东; 5：辽宁; 6：吉林; 7：上海; 8：贵阳; 9：成都; 10：宁夏; 11：石河子1：Beijing; 2：Tianjin; 3：Hebei; 4：Shandong; 5：Liaoning; 6：Jilin; 7：Shanghai; 8：Guiyang; 9：Chengdu; 10：Ningxia； 11：Shihezi

2.2 药敏试验

2.2.1 牛奶源大肠杆菌对18种抗菌药物的耐药结果 对分离纯化获得的大肠杆菌菌株进行临床抗菌药物敏感性试验，结果显示，2017年分离到的252株大肠杆菌，对氨苄西林及多西环素的耐药率高，分别为40.98%和36.63%，其次是头孢曲松(31.28%)、链霉素(29.23%)、头孢噻肟(22.50%)、氟甲砜霉素(22.42%)和氯霉素(19.26%)，对人医临床非常重要的2类药物多黏菌素和美罗培南未发现耐药或耐药率极低，分别为0.47%和0；2018年分离到的435株大肠杆菌，对氨苄西林及链霉素的耐药率高，分别为25.74%和19.59%，其次是头孢曲松(18.00%)、头孢噻肟(17.08%)和多西环素(14.35%)，而亚胺培南和美罗培南未发现耐药；其中18种抗菌药物的耐药率均未超过50.00%。牛奶源大肠杆菌菌株对18种抗菌药物的药物敏感性试验结果见表1。

表1 679株牛奶源大肠杆菌对18种抗菌药物的敏感性试验Table 1 Antimicrobial susceptibility of 679 E. coli isolates to 18 antibiotics (%)

2.2.2 2017—2018年重点区域牛奶源大肠杆菌对18种抗菌药物的耐药结果 对分离纯化获得的大肠杆菌菌株进行临床抗菌药物敏感性试验，结果显示，在样品采集的11个奶牛重点养殖区域中，上海、贵阳、宁夏3个地区奶牛源大肠杆菌耐药性最严重，上海地区牧场大肠杆菌对氨苄西林耐药率达88.89%，其次是贵阳58.82%；京津冀区域中以β-内酰胺类药物(氨苄西林49.08%，头孢曲松32.07%，头孢噻肟27.73%)、链霉素(22.84%)、多西环素(23.47%)和氯霉素类(7.33%)耐药为主，在这3个区域中天津地区大肠杆菌耐药最严重(氨苄西林耐药达80.65%)，其次是河北地区奶牛牧场，北京牧场最轻，河北地区阿米卡星耐药率5.71%；辽宁和吉林地区牛奶源大肠杆菌耐药谱相似，耐药率最高的5类药物均为氨苄西林(30.82%)、头孢曲松(25.40%)、头孢噻肟(23.54%)、链霉素(20.14%)和多西环素(16.41%)；山东地区牛奶源大肠杆菌对临床18种抗菌药物耐药率较低，耐药率最高为环丙沙星，仅20.00%，其次是氨苄西林(17.50%)和恩诺沙星(15.00%)；成都区域对牛奶源大肠杆菌耐药率最高的几类药物分别是链霉素(26.92%)、氨苄西林(19.23%)和庆大霉素(17.31%)，其中头孢西丁耐药程度在11个区域中最高，达到13.46%，高于上海地区的11.11%和贵阳地区的10.00%；新疆石河子地区在11个地区奶牛牧场中，耐药率最低，介于0～14.29%，链霉素耐药率最高(14.29%)，远低于上海(44.44%)、宁夏(37.50%)、吉林(29.17%)和天津地区(29.03%)的耐药率。

碳青霉烯类(亚胺培南、美罗培南)和多黏菌素类药物在11个地区牛奶源大肠杆菌中均未检测到耐药性[北京地区的多黏菌素(0.76%)除外]；氨基糖苷类药物的阿米卡星和安普霉素除个别牧场外(河北地区阿米卡星5.71%、宁夏地区安普霉素6.25%)，均处于极低耐药水平，极低于同类药物的庆大霉素、新霉素和链霉素的耐药率。重点区域规模化牧场大肠杆菌分离株对18种抗菌药物的药物敏感性试验结果见表2和图2。

图2 2017—2018年重点区域规模化牧场679株牛奶源大肠杆菌对18种抗菌药物的敏感性试验Fig.2 Antimicrobial susceptibility of 679 E. coli isolates to 18 antibiotics during 2017—2018AMP：氨苄西林; CAZ：头孢他啶; CRO：头孢曲松; CTX：头孢噻肟; FOX：头孢西丁; AMK：阿米卡星; APR：安普霉素; GEN：庆大霉素; NEO：新霉素; STR：链霉素; DOX：多西环素; CHL：氯霉素; FFC：氟甲砜霉素; CL：多黏菌素E; IMP：亚胺培南; MEM：美罗培南; CIP：环丙沙星; ENR：恩诺沙星AMP：Ampicillin; CAZ：Ceftazidime; CRO：Ceftriaxone; CTX：Cefotaxime; FOX：Cefoxitin; AMK：Amikacin; APR：Apramycin; GEN：Gentamycin; NEO：Neomycin; STR：Streptomycin; DOX：Doxycycline; CHL：Chloramphenicol; FFC：Florfenicol; CL：Colistin; IMP：Imipenem; MEM：Meropenem; CIP：Ciprofloxacin; ENR：Enrofloxacin

表2 2017—2018年重点区域规模化牧场679株牛奶源大肠杆菌对18种抗菌药物的敏感性试验Table 2 Antimicrobial susceptibility of 679 E. coli isolates to 18 antibiotics during 2017—2018 (%)

3 讨论

随着奶牛乳房炎致病菌的耐药性逐渐加重，临床上使用抗菌药物的防治效果也越来越差，且同一种属的不同菌株对不同的抗菌药物的敏感性也存在极大的差异[8]。牛奶中抗菌药物的残留不仅会导致乳制品质量下降，还会危及人类健康[9]。所以，正确的抗菌药物敏感性试验结果，对该地区养殖户以及临床兽医合理用药具有重要的参考价值，并可降低对人类健康的危害[10]。因此，本研究对牛奶源大肠杆菌进行了分离鉴定和药敏试验。

本研究从牛奶样品中共分离出687株菌株，通过形态学观察、革兰染色、生化特性分析及分子生物学方法对其进行综合鉴定，均为大肠杆菌。分离鉴定结果显示，贵阳地区的分离率最高，为52.99%，说明该地区大肠杆菌引起的奶牛乳房炎最为严重。京津冀鲁区域中，北京地区的分离率最高，可能与经济交通发达有关。东北区域的分离率相似，可能与气候和地理环境相似有关。上海地区的分离率最低，为9.29%，说明该地区大肠杆菌引起的奶牛乳房炎的防治效果较好，其奶牛场环境卫生与奶牛饲养管理方面俱佳，有效防控了奶牛乳房炎的发生和流行。石河子地区属于典型的温带大陆性气候，温差较大，日照时间充足，这为大肠杆菌传播提供了有利的条件，因此本研究中该地区大肠杆菌的分离率高居第2位，为37.57%。成都地处四川盆地，属于亚热带季风性湿润气候、气候温和、雨量丰沛，有利于大肠杆菌的生长繁殖，因此本研究中该地区大肠杆菌的分离率也高达35.37%。

本研究对687株大肠杆菌进行18种抗菌药物的敏感性试验分析，结果表明大肠杆菌对临床上使用的抗菌药物均产生了不同程度的耐药，尤其对氨苄西林、链霉素及多西环素的耐受性最高，其可能是由于该奶牛场长期使用上述常规抗生素或此菌株由牛场外传入引起奶牛发病，在传入之前已经对上述常规抗生素产生耐药性。而对多黏菌素、亚胺培南和美罗培南的耐受性极低甚至无耐受性，该试验结果基本能反映目前全国重点区域对部分抗菌药的耐药性情况。因此，在治疗因感染大肠杆菌而致的奶牛乳房炎时，应选用经药敏试验确证为高效的2～3种敏感药物，按疗程和足够的剂量交替治疗，减少抗生素残留和耐药性的危害，降低奶牛乳房炎的治疗成本[11]。

徐继英等[12](2012年)的研究结果中，国内7个省、市、自治区部分地区乳样中大肠杆菌的分离率低于本试验，且对阿米卡星、庆大霉素和氯霉素的耐药性高于本试验；张连梅等[13](2013年)报道的宁夏地区奶样中大肠杆菌的分离率低于本试验宁夏地区的分离率；余婷等[14](2013年)对宁夏地区奶牛场分离出大肠杆菌的耐药性进行分析，结果显示对氨苄西林、头孢噻肟、链霉素、庆大霉素、多西环素和多黏菌素的耐药性高于本试验，而对恩诺沙星和环丙沙星的耐药率低于与本试验；孙芳芳等[15](2014年)报道的沈阳地区奶牛场奶样大肠杆菌的分离率与本试验辽宁地区大致相同，其中氨苄西林与链霉素的耐药率与本试验辽宁地区基本相同，而庆大霉素与环丙沙星的耐药率与本试验辽宁地区有一定差异；贾林军等[16](2014年)对新疆地区的奶样进行了分离鉴定，大肠杆菌的分离率为9.5%，低于本试验新疆地区，其中对氨苄西林、庆大霉素和链霉素耐药率高于本试验新疆地区；刘春杰等[17](2014年)研究结果显示，吉林奶牛场的乳样分离率为24%，与本试验吉林地区基本相同，且对环丙沙星的低耐药率与本试验吉林地区基本相同，而对氨苄西林和庆大霉素的耐药率与本试验吉林地区有一定差异；杨淑华等[18](2015年)报道的辽宁地区奶牛场采集的乳样中大肠杆菌的分离率为20.26%，与本试验辽宁地区基本相同；薛梅等[19](2015年)对山东省奶牛场采集的奶样进行分离鉴定，大肠杆菌的分离率为16.32%，与本试验山东地区基本相同，且对头孢噻肟的低耐药率与本试验山东地区基本相同，而对链霉素、阿米卡星和恩诺沙星的耐药率高于本试验山东地区；许丹丹等[20](2015年)从新疆石河子地区奶牛场采集的313份奶样中分离出16株大肠杆菌，分离率为5.11%，低于本试验新疆地区，且对庆大霉素、氨苄西林、链霉素的耐药率高于本试验新疆地区；姚伟等[21]等(2016年)报道的辽宁地区某大型奶牛场采集的奶样中大肠杆菌分离率为76%(57/75)，远高于本试验辽宁地区，且对庆大霉素的低耐药率与本试验辽宁地区相同，而对氨苄西林、多西环素、环丙沙星、恩诺沙星的耐药率高于本试验辽宁地区；杨彩霞等[22](2016年)的研究结果表明，辽宁地区16家规模化奶牛场采集奶样中大肠杆菌的分离率为55.63%，高于本试验辽宁地区，且对氨苄西林、链霉素、氯霉素和多西环素的耐药率与本试验辽宁地区基本一致，而对多黏菌素的高耐药率与本试验辽宁地区相反；高晓伟等[23](2016年)从吉林长春地区采集的231份奶样中分离出54株大肠杆菌，分离率为23.37%，与本试验吉林地区基本相同，且对链霉素、环丙沙星的耐药率与本试验吉林地区基本相同，而对多西环素、庆大霉素的耐药性与本试验吉林地区有一定差异；张倩等[11](2016年)报道的新疆石河子地区规模化牛场的85份奶样中分离出大肠杆菌27株，占31.76%，与本试验新疆地区基本相同，且对阿米卡星、恩诺沙星、氟甲砜霉素的耐药率与本试验石河子地区基本相同，而对氨苄西林、多黏菌素的耐药率高于本试验石河子地区；王雪梅等[24](2017年)对四川成都地区采集的奶样进行分离鉴定，大肠杆菌分离率为14.16%，低于本试验成都地区，且对链霉素的耐药率低于与本试验成都地区，而对头孢噻肟和庆大霉素的耐药率远远高于本试验四川地区；李宁等[25](2018年)的研究结果显示，辽宁地区采集的89份奶样中分离出25株大肠杆菌，分离率28.09%，与本试验辽宁地区基本相同，且对头孢噻肟的耐药性与本试验辽宁地区基本相同，而对头孢西丁、阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南及环丙沙星的耐药率均高于与本试验辽宁地区。

由此可见，不同地区大肠杆菌的分离率存在不同程度的差异，这不仅与奶牛场环境卫生、奶牛饲养管理和用药习惯等有关系，还与气候和地理环境等有直接关系。因此，应加强奶牛的饲养管理，改善牛舍及周围环境卫生，保持牛舍通风干燥且定期清洗牛舍和对牛舍进行灭菌消毒。此外，要定期对奶牛进行检查，对久治不愈的临床型乳房炎患牛应淘汰。同时应规范挤奶程序，做好挤奶用具的消毒工作，防止挤奶过程中的微生物感染。