基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对羊源多杀性巴氏杆菌的快速鉴定

姜彦芬 ， 王金凤 ， 孙晓霞 ， 李睿文 ， 刘立兵 ， 袁万哲 ， 王建昌

(1.石家庄海关技术中心 , 河北 石家庄 050050 ； 2.河北农业大学动物医学院 ， 河北 保定 071001)

多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，Pm)是一种革兰阴性短杆菌，根据其荚膜抗原差异，可归类为A、B、D、E、F五种血清型[1]，我国主要流行的是A、B、D三种血清型。多杀性巴氏杆菌是一种在动物中广泛存在的机会性致病菌，可引起禽霍乱、猪肺疫、猪萎缩性鼻炎，引起山羊和绵羊呼吸道疫病，引起牛和兔出血性败血症，也是牛呼吸道综合征的重要细菌性病原之一[1-2]。多杀性巴氏杆菌病多发生于春、秋季节，传播快，死亡率高，常呈地方性流行，一旦患病，将给养殖业造成重大的经济损失，因此需要一种快速、及时准确地鉴定多杀性巴氏杆菌的方法，为该病早期防控提供有效的技术支撑。

常规细菌分离鉴定方法操作繁琐、检测时间较长、且需要专业的技术人员。商业化生化鉴定卡API 20E/20 NE能够实现常见致病菌的快速、有效和便捷鉴定，但是不能有效区分多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌[3]。目前多杀性巴氏杆菌的分子生物学鉴定方法有16S rRNA测序、实时荧光PCR方法、环介导等温扩增(LAMP)方法和重组酶聚合酶扩增(RPA)方法[4]，但仍需要核酸提取、靶基因扩增或基因测序和序列比对分析等步骤，同时由于操作核酸过程中容易产生气溶胶和扩增的高灵敏性，使鉴定结果容易出现“假阳性”，导致对细菌近似种的鉴定存在无法区分。

近年来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)作为一种新型微生物鉴定技术，已广泛应用于食源性致病菌、动物源性致病菌和临床微生物的快速鉴定[5]。其基本原理是微生物样品与基质在靶板上结合形成共晶体，利用激光照射共晶体，基质从激光中吸收能量使样品解吸附，基质与样品之间发生电荷转移使样品分子电离，经过质谱飞行检测器进行质量分析，检测器检测到不同质荷比(M/Z)的离子，并以离子质荷比为横坐标，以离子峰为纵坐标形成特异性的病原菌蛋白质组指纹图谱[6]，进而与图库中图谱进行比对，从而实现对待测菌株种、属乃至亚种水平的快速鉴定。本试验通过MALDI-TOF MS方法，对分离自突然死亡绵羊的多杀性巴氏杆菌菌株进行鉴定，取得了与传统生化方法和16S rRNA测序方法一致的结果。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备 绵羊血琼脂平板，购自河南安图生物工程股份有限公司；营养琼脂平板，购自青岛海博生物技术有限公司；70%甲酸、乙腈、三氟乙酸(均为色谱级)，均购自赛默飞世尔科技有限公司；无水乙醇，购自天津市致远化学试剂有限公司；色谱级α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、细菌实验标准品(BTS)，购自德国布鲁克公司；GN鉴定卡，购自生物梅里埃美国股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、HPLC超纯水，均购自北京索莱宝科技有限公司；2×EasyTaq®PCR SuperMix，购自北京全式金生物技术公司；ZymocleanTMGel DNA Recovery Kit，购自ZYMO RESEARCH公司；pTOPO-T载体，购自北京艾德莱生物科技有限公司。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(Autoflex speed TOF/TOF)，德国布鲁克公司；全自动微生物鉴定系统VITEK2(Compact)，美国生物梅里埃公司；ProFlexTMPCR系统(ProFlex)，美国Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 分离菌纯化鉴定 无菌采集因口吐白沫、后肢瘫痪而突然死亡的绵羊肺脏和肝脏，用灼烧过的手术刀烫烙剖面，无菌剪刀剪开切面，将一次性无菌接种环插入深层组织刮蹭，分区平板划线接种于绵羊血琼脂，37 ℃低温培养箱培养24 h，观察可疑菌落形态和生长特征。挑取24 h新鲜菌落涂片进行革兰染色。

1.2.2 MALDI-TOF MS对分离菌的鉴定

1.2.2.1 溶液配制 将色谱级乙腈、三氟乙酸和HPLC级超纯水按照比例(500、25 μL和475 μL)配制出1 mL标准溶剂，于振荡器上充分混匀，备用。取250 μL备用标准溶剂至IVD HCCA的存液管中，室温下涡旋混匀至黄色颗粒完全溶解，获得基质溶液。另取50 μL标准溶剂加入到IVD BTS固体颗粒管中，反复吹打混匀溶解，室温13 000 r/min离心2 min，移取5 μL上清液，获得BTS溶液。

1.2.2.2 分离菌提取 将分离菌使用甲酸萃取法进行蛋白样本制备。在纯化后的营养琼脂平板上用一次性无菌接种环取足量单菌落，重悬于装有300 μL超纯水的离心管中，用移液器反复吹打，形成均匀的混悬液。加入900 μL无水乙醇，充分混匀，静置15 min后13 000 r/min离心2 min，弃掉上清液。继续13 000 r/min离心2 min，吸弃上清液。室温放置至乙醇完全挥发。然后加入50 μL 70%甲酸溶液，涡旋混匀，充分重悬细菌沉淀，再加入等体积乙腈，充分混匀。13 000 r/min离心2 min获得离心微生物萃取物。

1.2.2.3 靶板制备 取1 μL离心后上清液加到MALDI-TOF MS靶板上，待自然干燥后，在靶板上加1 μL CHCA基质溶液涂敷覆盖。同时选取靶板另一位置靶点加1 μL BTS标准品溶液，干燥后，加1 μL CHCA基质溶液涂敷覆盖，此靶点用于仪器的校正。室温下晾干时间约为15 min，将靶板送入检测仓待检。

1.2.2.4 质谱采集和结果鉴定 运用 FlexControl 软件对样品进行数据采集，选择线性操作模式和正离子模式，检测范围为2 000～20 000 Da。应用BioTyper 软件将采集样品的图谱与数据库中标准图谱进行比对，结果会给出与鉴定菌最相似的10个菌种，并给出相应分值：匹配分值在2.300以上，表示菌种鉴定可信度高(+++)；匹配分值在2.000～2.299，表示可信的菌属鉴定和可能的菌种鉴定(++)；匹配分值在1.700～1.999，表示可能的菌属鉴定(+)；匹配分值在0.000～1.699，表示鉴定结果不可信(-)。

1.2.3 VITEK2 Compact生化鉴定 用一次性无菌接种环挑取营养琼脂平板纯培养后的单菌落，加入3 mL 0.45% NaCl盐水，用移液器吹吸制备菌悬液。使用浊度仪调节菌悬液浓度在0.50～0.63麦氏浊度。根据细菌革兰染色结果，选用VITEK 2 GN鉴定卡，应用VITEK2 Compact全自动微生物鉴定系统对分离菌进行生化鉴定。

1.2.4 16S rRNA测序鉴定 提取分离菌基因组DNA，根据参考文献[7]中反应条件进行分离菌16S rRNA基因的扩增，片段大小约为1 500 bp。回收目的片段，连接pTOPO-T载体，转化JM109感受态细胞。挑取转化后单菌落，37 ℃摇菌，将鉴定正确的菌液送北京中科西林生物科技有限责任公司测序。登录NCBI数据库，利用 BLAST 程序对分离菌的测序结果进行序列比对。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定 经24 h培养后，绵羊血平板上可见光滑、半透明、不溶血、灰白色、露珠状小菌落。镜检为革兰阴性，短杆状细菌。

2.2 MALDI-TOF MS鉴定 通过MALDI-TOF MS 检测及 BioTyper 软件分析，与MALDI-TOF MS自带数据库中约6 000株标准指纹图谱进行比对分析，与数据库中10株多杀性巴氏杆菌标准菌株进行比对。结果如图1所示，分离菌蛋白指纹图谱基线平稳，蛋白峰多，结果良好。分离菌鉴定为“多杀性巴氏杆菌”，匹配分值为2.371，标记为(+++)，达到种水平的鉴定，说明鉴定可信度高，可完全确认菌株鉴定结果。数据库比对结果及鉴定结果报告见图2。

图1 分离菌株MALDI-TOF MS蛋白质指纹图谱Fig.1 MALDI-TOF MS protein fingerprint of bacterial isolate

图2 分离菌株蛋白指纹图谱与数据库标准图谱比对结果Fig.2 Comparison of protein fingerprint between bacterial isolate and database standard纵坐标0.0以上为分离菌株的特征峰图谱，以下为数据库中多杀性巴氏杆菌标准图谱The characteristic peak map of the isolated bacteria was above the vertical coordinate of 0.0,the below was the standard fingerprint map of Pasteurella multocida in the database

2.3 VITEK2鉴定 通过VITEK2 Compact全自动微生物鉴定系统，使用VITEK 2 GN鉴定卡对分离菌的48项生化指标进行鉴定，结果鉴定为多杀性巴氏杆菌。

2.4 16S rRNA鉴定 经PCR扩增反应后，凝胶电泳结果可见大小约为1 500 bp的条带，回收目的片段，连接pTOPO-T载体，转化后挑取阳性克隆送菌液测序。将菌液测序结果在NCBI中进行BLAST比对，与数据库中已公布的多杀性巴氏杆菌的参考株同源性在99.65%～99.79%，因此分离菌株鉴定为多杀性巴氏杆菌。

3 讨论

羊巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的山羊和绵羊的一种重要传染病，多发于绵羊，经常突然发病，一旦发生，往往来不及治疗，对羊养殖业造成严重的经济损失。因此，对多杀性巴氏杆菌的快速、准确鉴定，可以使饲主对病畜及时采取治疗，从而阻止病情愈发严重。

本试验通过MALDI-TOF MS方法实现了对分离自发病绵羊的多杀性巴氏杆菌的快速鉴定，结果同传统的生理生化方法和经典的16S rRNA测序方法鉴定结果一致。与传统生化方法和16S rRNA测序方法相比，MALDI-TOF MS鉴定方法具有快速、准确、高通量、重复性和稳定性好的特点，能够充分满足疫病病原临床诊断的要求。基于对微生物胞内固定表达的高丰度-核糖体蛋白的分析，MALDI-TOF MS法可实现对微生物高准确性和重复性的鉴定，并且不会因培养基和培养条件的不同而导致结果产生较大差异[8]。在MALDI-TOF MS检测过程中，样品前处理简单易行，不需要基因组DNA的提取和PCR反应扩增，一般通过直接涂抹法或甲酸萃取法进行样品前处理即可；上机后1 min内即可获得鉴定结果；靶板一次可实现384个样品高通量检测；耗材成本低，仅需少量基质，靶板可反复清洗使用。梁达炜等研究表明，在应用MALDI-TOF MS法鉴定沙门氏菌过程中，成本约为VITEK2的1/3，检测时间约为VITEK2的1/2[9]。谢田刚等研究表明，传统生化鉴定方法需要3 h左右获得对铜绿假单胞菌的鉴定结果，而MALDI-TOF MS方法则仅需要30 min左右[10]。研究表明，在样品前处理过程中，采用直接涂抹法虽然简便，但因其容易受涂布菌量、培养基基质和涂抹均匀程度的影响，导致图谱重复性交叉，鉴定结果不准确；使用甲酸萃取法得到的蛋白指纹图谱基线更平稳，蛋白峰更多，重复性更好[11]。本试验中，从获得纯菌落到得到细菌鉴定结果，VITEK2方法需要4 h左右，16S rRNA测序方法则至少需要2 d；而 MALDI-TOF MS采用甲酸萃取法进行样品前处理，则仅需要约30 min即可获得鉴定结果。

MALDI-TOF MS对细菌进行鉴定的同时，还可以基于数据库进行同源性分析，对分离菌株进行溯源[12-13]。基于质谱仪构建数据库功能，可以将某一地区或农场分离的多杀性巴氏杆菌进行蛋白指纹分析，获得所有分离株的蛋白指纹图谱后，自建该地区或农场的多杀性巴氏杆菌数据库，进而能够快速获得新分离多杀性巴氏杆菌的鉴定结果，同时可以进行细菌聚类分析。通过聚类分析，构建系统树，可以分析细菌在不同差异水平时的分型，从而进一步分析菌株之间的亲缘关系，实现对新分离多杀性巴氏杆菌的有效溯源。这也是本课题组下一步研究的重要内容。