河南许昌地区规模化肉鸡场滑液囊支原体的分离鉴定及耐药性检测

李水德

(许昌市建安区职业中等专业学校 ， 河南 许昌 461143)

支原体主要感染禽类及哺乳动物的呼吸系统和生殖系统，还可引发关节炎、乳腺炎和眼炎等[1]。国内相关研究显示，危害禽类的支原体有28种，临床以鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和火鸡支原体3种较为常见，尤其是鸡滑液囊支原体和鸡毒支原体感染最为严重，其对种鸡感染率可达50%以上，支原体感染先后在加拿大、英国、挪威、德国、法国、南非等国家报道，呈世界性分布，给养鸡业造成严重的经济损失[2-3]。国外研究表明，鸡滑液囊支原体和鸡毒支原体对肉种鸡危害较严重，尤其鸡滑液囊支原体感染率可达20%以上，主要防控措施以净化为主[4]。鸡滑液囊支原体病以关节肿大、滑液囊、肌腱炎及实质器官的肿大为主要特征，病鸡和隐性感染鸡群是主要传染源，该病一旦在鸡群中感染可引发一系列疾病，导致雏鸡生长迟缓，严重者可导致死亡，产蛋鸡产量下降，且易与其他病原体混合感染，很难根除，给养鸡业造成严重的经济损失[5-6]。临床中支原体主要通过抗生素防控，随着抗生素的使用，其耐药性越来越严重，耐药菌株逐渐增多，严重影响其治疗效果[7]。本试验主要对许昌地区规模化肉鸡场滑液囊支原体感染情况进行检测，并分析其耐药性，为该地区的肉鸡场鸡滑液囊支原体临床合理用药及防控提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 病料来源 2018—2019年，采集许昌地区规模化肉鸡场疑似滑液囊支原体感染的病料组织179份。

1.2 主要试剂 PPLO液体培养基、改良Frey液体培养基、改良Frey固体培养，均购自广东环凯微生物科技有限公司；抗支原体类抗菌药的药敏纸片，购自北京天坛药物生物技术开发公司；DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒，均购自北京索莱宝科技有限公司；DL 2 000 Marker、2×TaqMaster Mix，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分离与培养 取疑似鸡滑液囊支原体感染的关节液病料组织，经过处理后接种于Frey液体培养基内密封，37 ℃恒温培养36～44 h，每日观察2～3次，待颜色变黄后过滤，传代4次后，将其接种于改良Frey固体培养基上，37 ℃恒温5%CO2培养箱中培养4～7 d，肉眼观察直到出现中央凸起呈荷包蛋样的典型支原体菌落，姬姆萨染色观察其形态学。

1.3.2 菌株DNA基因组提取 取中央凸起呈荷包蛋样的典型支原体菌落的菌株，按照DNA提取试剂盒说明书提取其菌株的DNA基因组，-20 ℃保存。

1.3.3 菌株PCR鉴定 参考文献[8]报道的鸡滑液囊支原体鉴定引物，根据GenBank中登录的鸡滑液囊支原体基因全序列，设计vlhA基因鉴定引物：5′-CACCGCCATTGCTCCTGTTATA-3′，5′-GGGTAGT-CCACTCGCACCTCTCGCATT-3′，目的片段大小为773 bp，引物由华大基因科技研究公司合成。以提取的菌株DNA基因组为模板，进行PCR鉴定，挑取鉴定阳性菌株用胶回收试剂盒回收PCR产物，送华大基因进行测序，其测序结果与NCBI网站下载参考株的基因序列用BLAST软件进行同源性比对。

1.3.4 药敏试验 将分离菌株接种于PPLO液体培养基中，均匀涂布在PPLO固体培养基上，每个培养基贴6种抗菌药纸片，每种抗菌药3个重复，取平均值。参照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准进行结果判断，分析其耐药性。

2 结果

2.1 分离培养 疑似鸡滑液囊支原体在改良Frey固体培养基上，37 ℃恒温5%CO2培养箱中培养4 d时，出现光滑、透明、圆形、似露珠状的菌落，呈现典型的“煎蛋样”菌落(图1)；通过吉姆萨染色油镜下可见卵圆形、弯曲的丝状、螺旋状等多形态菌株(图2)，与《伯杰细菌鉴定手册》中支原体培养特性、形态学基本一致。经过统计87株菌株初步鉴定为支原体。

图1 菌株的“煎蛋样”菌落Fig.1 “Fried egg like” colonies of the strain

图2 显微镜下的菌株形态(1 000×)Fig.2 Microscopic morphology of the strain(1 000×)

2.2 PCR鉴定 对初步鉴定的87株支原体，用鸡滑液囊支原体vlhA基因鉴定引物进行PCR鉴定，结果显示，87株支原体均扩增出大小约为773 bp的目的条带(图3)，其测序结果用BLAST软件进行同源性比对，分离的87株鸡滑液囊支原体与GenBank中登录的参考株同源性介于97.9%～99.7%。

图3 鸡滑液囊支原体分离株的PCR鉴定结果Fig.3 PCR identification results of Mycoplasma synovialis stainsM:DL-2 000 marker； 1～5:分离菌株； 6:空白对照M：DL-2 000 marker; 1-5:Isolated strains; 6:Blank control

2.3 耐药性分析 用K-B药敏纸片法对分离的87株鸡滑液囊支原体进行药敏试验，分析其耐药性。结果如表1所示，分离的87株鸡滑液囊支原体对临床中不同的抗菌药均产生耐药性，对金霉素、土霉素、吉他霉素、替米考星、多西环素、泰乐菌素和林可霉素耐药率分别为98.8%、94.3%、90.7%、78.2%、61.5%、58.8%和57.7%，对阿奇霉素、泰妙菌素、环丙沙星、恩诺沙星和沙拉沙星5种抗菌药耐药率较低，耐药率介于10.3%～17.9%。

表1 87株鸡滑囊支原体的耐药试验结果Table 1 Drug resistance test results of 87 Mycoplasma synovialis strains

临床中分离的87株鸡滑液囊支原体呈现多重耐药性，耐12种抗菌药有2株、耐11、3种抗菌药各有4株、耐10种抗菌药有5株、耐9、4种抗菌药各有7株、耐5种抗菌药有12株，其中耐8、7、6种抗菌药分离菌株最多，分别占分离菌株的16.1%、17.2%和19.5%(图4)。

图4 多重耐药性检测结果Fig.4 Results of multidrug resistance test

3 讨论

鸡滑液囊支原体可以引起不同阶段的鸡和火鸡发生传染性滑膜炎、呼吸系统、全身性疾病及自身免疫性疾病等一系列疾病，呈世界性流行[8-9]。鸡滑液囊支原体发病无明显的季节性，一年四季均可发生，以冬春季节易发，可以感染各种日龄鸡，该病可以水平传播也可以垂直传播，尤其是种鸡通过卵传播给子代，在种鸡感染初期经卵传播率较高，不同菌株具有不同的致病力，且在鸡群中长期存在[10-11]。招丽婵等[3]报道从广东、广西、江苏、浙江、福建等10个不同地区养殖场中分离到96 株鸡滑液囊支原体田间流行株。王昆等[7]从山东潍坊市某养鸡场分离得到鸡滑液囊支原体。说明该支原体在全国鸡场广泛流行。规模化养殖场中该支原体广泛流行主要是由于防控措施不健全、生物安全的漏洞等，不注重该病原体的净化，是导致其流行的主要原因之一。本试验从许昌地区规模化肉鸡场采集疑似鸡滑液囊支原体感染的179份病料组织中分离得到87株鸡滑液囊支原体，说明该地区鸡滑液囊支原体感染严重，应该注意其防控与净化。

由于该病疫苗效果不太理想，临床中主要用抗生素进行防控，由于抗生素的不合理使用，导致其耐药菌株出现，给该病的防治带来了一定的困难[12]。当发生鸡滑液囊支原体感染时应该进行药敏试验，选择敏感药物合理使用，提高治疗效果，同时配合消毒。本试验结果显示，分离的鸡滑液囊支原体对临床中常用抗菌药均出现严重耐药性，应该引起重视。本试验结果与隋兆峰等[12]、石晓磊等[13]报道的鸡滑液囊支原体耐药性存在一定差异性，可能与地区及使用抗菌药的种类有关。本试验结果为许昌地区规模化肉鸡场滑液囊支原体的防控提供了参考依据。