鳖龙软肝汤抗肝纤维化-肝癌“多成分-多靶点”的网络药理学研究*

肝癌是全球第二大癌症相关死亡原因，患者5年总体生存率约18%

；肝损伤因素如肝炎病毒感染、酒精和黄曲霉素摄入、遗传代谢性疾病、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝病、胆汁淤积等引起肝细胞损伤，炎症细胞浸润和广泛的组织重塑、血管结构紊乱和组织缺氧，最终导致进行性肝纤维化、肝硬化或肝癌

。肝纤维化是一种肝脏对各种慢性损伤所产生的修复反应，炎症细胞浸润和广泛的组织重塑、血管结构紊乱和组织缺氧，促进了纤维化的发展，最终导致肝硬化甚至肝癌

。肝癌的发生存在“肝炎-肝纤维化/肝硬化-肝癌”的序列演进规律

。肝纤维化是所有慢性肝脏疾病共有的病理学基础，阻止和/或延缓肝纤维化发生，可延缓肝硬化和原发性肝癌的发生。因此，寻求有效的药物阻断或逆转肝纤维化的发生和发展，是防止“肝炎-肝纤维化/肝硬化-肝癌”序列演进的重点。

鳖龙软肝汤(BLRGD)原名“疏肝理脾Ⅱ号方”，是治疗肝纤维化的重要中药方剂，治以活血化瘀为主，配以滋阴益气健脾。鳖龙软肝汤由鳖甲、地龙、茯苓、桃仁、莪术、柴胡、白芍等药材组成，前期研究发现鳖龙软肝汤有较好的抗肝纤维化、抗肝癌的作用，并有效改善脾虚血瘀的作用

。本研究采用网络药理学的方法，探讨BLRGD抗肝纤维化-肝硬化-肝癌(HF-LC-PLC)“多成分-多靶点-多通路”的作用机制，为BLRGD治疗HF-LC-PLC提供理论依据。

此后，生态语言学的理念逐渐引入英语教学的研究领域，国内部分学者开展了相关研究，马瑞娟、任丽及吴宗会以生态语言学为视角分别探讨如何改革本科及研究生公共英语教学，其研究仅涉及本科或研究生公共英语。

阿米东索神山，孤峰独秀，气势磅礴，是祁连县的象征，因其形似牛心，所以又被称为牛心山。牛心山海拔4667米，积雪常年不化，皑皑雪峰在蓝天白云的映衬下分外壮美。

1 材料与方法

1.1 药物活性成分筛选 基于TCMSP数据库，以“白芍”“柴胡”“莪术”“茯苓”“桃仁”为检索词，选取中药的化合成分。以OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4作为筛选条件，过滤获取每味中药的化合成分及对应的药物靶点。鳖甲、地龙潜在靶点的反向预测及筛选通过并在PubChem数据库中获取相关成分SDF格式化学结构，所有化学结构均采用ChemBio 3D Ultra软件转换为Mol2文件格式，将鳖甲、地龙化学成分Mol2格式结构文件，上传至PharmMapper服务器，以活性小分子为探针，搜寻潜在药物靶点，得到虚拟筛选和预测化合物生物活性。通过UniProt数据库(http://www.Uniprot.org/)中的UniProtKB检索药物靶点，输入蛋白名称并限定物种为“Homo sapiens”，将检索得到的所有靶点进行校正。

1.4 GO功能及KEGG富集分析 将DDT结果输入至KOBAS在线数据库进行GO功能和KEGG富集分析，分别通过OmicShare平台(http://www.omicshare.com/)和Cytoscape3.7.1软件对GO和KEGG富集分析结果进行可视化。

2.2 DDT网络构建及可视化 共得到鳖龙软肝汤中116个药物靶点，通过GeneCards上检索到关于疾病的3 063个靶点(肝硬化4 179个靶点，肝纤维化6 431个靶点，原发性肝癌14 853个靶点，三者交集为3 063个靶点)，将两者进行交集处理，共得到64个药物疾病靶点，详见图1。利用Cytoscape3.7.1软件对DDT进行网络可视化，详见图2。

2.4 GO富集分析 将所得到的64个药物疾病靶点，通过KOBAS数据库进行GO功能富集分析，共得到87条功能注释。通过OmicShare平台对BP、MF和CC进行排名，根据P值和富集靶点数靠前的GO富集分析结果进行排序。详见图4、表2。

首先，你们要加强心理康复能力，拿到修复能量！这需要你们掌握一些能转移情绪、宣泄痛苦的心理调节手段。如果你们忙得像陀螺一样，还能挤点时间放松自己，或者在心情不佳的时候转移注意力，能让自己始终像太阳一样明媚，那我可能会被“晒伤”，没办法对你们施加影响了。

2 结果

课题组前期研究发现，在牛血清白蛋白(BSA)复制的大鼠肝纤维化模型，鳖龙软肝片具有保护肝细胞，抑制大鼠肝脏胶原纤维合成及抑制肝脏纤维组织增生的作用

；鳖龙软肝片能显著性降低慢性乙型肝炎患者FibroIndex积分值，有抗慢性乙型肝炎患者肝纤维化的疗效

；BLRGD联合经肝动脉化疗栓塞术治疗HBV相关原发性肝癌，可改善患者生活质量，提高近期疗效

。提示BLRGD有较好的抗肝纤维化、抗肝癌的作用，并有效改善脾虚血瘀的作用，但具体机制尚不明确。

本文在借鉴相关研究结果的基础上，对当前湖南省城市化与生态环境的耦合协调发展阶段与状态进行研究分析，并提出了相关的改善措施，对推进湖南省新型城市化建设，提高省域内城市化与生态环境协调度具有一定的借鉴意义。但由于城市化与生态环境内部各要素之间交互耦合关系较为复杂，无论是在构建指标体系方面，还是研究方法及模型运用等方面难免存在不足与缺陷，仍需深入研究。同时，关于城市化与生态环境耦合关系、相关性的研究方法还有很多[20]，如数据包络分析法、德尔菲法、生态足迹法等等，本文由于数据限制，目前的指标体系还很难全面刻画城市化与生态环境的全部内涵，更为全面、合理的指标体系的构建值得进一步探讨。

1.2 药物-疾病靶点(DDT)网络可视化分析 利用GeneCards数据库以“Hepatic Fibrosis、Cirrhosis、Liver Cancer”为检索词，收集与疾病相关的靶点。运用Interactivenn平台(http://www.interactivenn.net/)将药物活性成分-疾病共同蛋白进行提取，所得交集即为DDT。通过Cytoscape3.7.1软件对Drug-Disease进行可视化网络分析的展示。

2.3 PPI网络的构建及可视化 通过String平台对得到的64个药物-疾病靶点进行PPI网络构建，然后利用Cytoscape 3.7.1软件对PPI结果行网络可视化分析。PPI网络最终得到共包含64个节点，128条边。根据Degree值对节点进行排序，排名前5的靶点为IL6、MAPK8、CCND1、RELA、ICAM1。详见图3。

1.3 构建蛋白互作网络 将DDT结果传至String平台进行PPI网络分析。设定物种为“Homo sapiens”，设定最低互动分数为0.400。运用Cytoscape3.7.1软件进行可视化分析。

祖国医学本无肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌等病名，据其具体临床表现可归属于“胁痛”“积聚”“癥瘕”“黄疸”“臌胀”等范畴

。目前普遍认为，肝癌的病因病机主以肝郁脾虚，以毒邪、血瘀、湿热、气滞为标

。肝癌癌前病变可分为气滞血瘀证、肝郁脾虚证、肝肾阴虚证、湿热内盛证及瘀毒蕴结证5个证型

，其中肝郁脾虚是形成HF-LC-PLC的主要内在基础

。疏肝健脾活血法为原发性肝癌的主要治法

。BLRGD由鳖甲、地龙、茯苓、桃仁、莪术、柴胡、白芍等药材组成，方中莪术、桃仁为君，莪术苦辛温，桃仁性味苦酸，均入肝经，行破血祛瘀、消积散之效。鳖甲、白芍、柴胡为臣，鳖甲性味咸微寒，入肝脾肾经，治以软坚散结、滋阴潜阳；白芍性味酸苦微寒，归肝脾经，养血敛阴；柴胡性味苦微寒，经归肝胆，行疏肝解郁、行气止痛之效；三味合用助君药活血化瘀之功，同时以鳖甲滋肝阴、白芍养肝血，可防莪术、桃仁活血破血过甚所致伤正。茯苓性味甘平为佐药，以淡渗利湿，健脾和胃，健胃消食，可改善便溏、腹胀、纳差等脾虚症状。地龙为使，性味寒咸，归肝脾经，具清热、利尿、通络之效，可调和诸药，使药力直达肝脾二脏，共奏疏肝健脾、活血化瘀之效，达到攻不伤正，补不留邪，攻补兼施，标本兼治之目的。

2.5 KEGG通路富集分析 通过KOBAS平台对64个DDT进行KEGG富集分析，共得到722条富集通路，富集排名靠前的通路主要有Metabolic pathways、TNF、Pathways in cancer等信号通路密切相关，详见图5、表3。通过Cytoscape软件对DDT与富集通路进行可视化网络，该网络共有174节点，532条边，详见图6。

3 讨论

在大数据技术的整个运行周期种，首要的环节就是数据采集，要依据Map Reduce产生的数据进行有效分类，先分布式局部计算得出结果再统一合并得到计算结果。

2.1 鳖龙软肝汤活性成分的筛选 共检索得到活性成分67个，见表1。

随着网络药理学的兴起与发展，利用网络药理学方法分析中药复方“多成分-多靶点-多通路”的技术日益成熟。本文通过网络药理学反向药效团匹配方法筛选BLRGD中化学成分的靶点基因，并与HF-LC-PLC靶点基因进行映射，发现64个相关度较高的靶点基因。将这些靶点基因进行GO富集和KEGG通路分析、化学成分-靶点-通路及蛋白互作网络分析，探讨BLRGD“多成分-多靶点-多通路”的作用机制。

通过分析中药-化学成分-靶点网络图及结合文献分析发现，paeoniflorgenone(芍药苷)，albiflorin(芍药内酯苷)，hederagenin(常春藤皂苷元)，bisdemethoxycurcumin(双去甲氧基姜黄素)是BLRGD抗HF-LC-PLC的核心化学成分。芍药苷通过调节巨噬细胞活性、抑制炎症因子表达、抗细胞凋亡、调节免疫反应、抑制α-SMA、Collagen-I等纤维化指标的表达及抗氧化应激发挥护肝作用

。在体外研究中发现，芍药苷能促进肝癌细胞凋亡，抑制肝癌侵袭及转移

。α-常春藤皂苷通过抑制肿瘤细胞增殖、 诱导肿瘤细胞凋亡、溶血活性、增加化疗药物的敏感性、诱导自噬及抑制肿瘤细胞转移等药理活性在人类结肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤发生发展过程中发挥抑癌作用

。双去甲氧基姜黄素(Bisdemethoxycurcumin)是从姜科植物根茎中提取的天然多酚类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗过敏、神经保护等多种药理活性。双去甲氧基姜黄素通过抑制TGF-β1、α-SMA和PI3K/Akt蛋白的表达治疗硫代乙酰胺诱导的小鼠肝纤维化

。双去甲氧基姜黄素能增加ROS生成和AMPK磷酸化水平，抑制p-STAT3表达从而抑制肝癌细胞增殖诱导肝癌细胞凋亡

。

肝癌发生机制复杂，可能与多种形式的肝炎病毒、长期过量饮酒、长期食用霉变的饮食或受污染的水以及接触化学毒药或寄生虫等因素相关，涉及多基因突变、一系列分子事件的动态变化，如信号通路活化、炎性细胞聚集、炎性因子过表达及氧化应激等。PPI 网络互作分析显示，IL6、MAPK8、CCND1、RELA、ICAM1等为BLRGD抑制HF-PLC的主要靶点， Metabolic pathways、TNF、Pathways in cancer、Wnt signaling pathway 、Chemokine signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway可能为BLRGD抑制HF-PLC的核心通路。提示BLRGD可能调节炎症微环境。

肝细胞癌(HCC)与不同病因引起的慢性炎症和纤维化有关。炎症微环境已被公认为肿瘤的第七大特征。肿瘤的启动、进展和转移等几个阶段均与炎症微环境的调控有关。巨噬细胞是肿瘤相关的炎症微环境中数量最多的一种炎症细胞，其数量可达炎症细胞总数的50%。研究亦发现，肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)与HCC的进展及不良预后密切相关

，TAMs在肿瘤组织中主要分泌IL-6、IL-1β、TNF-α、细胞黏附因子(ICAM)等，激活增殖、转移及血管生成相关信号通路发挥促瘤功能

。

网络药理学结果提示，BLRGD抗HF-LC-PLC是一个“多成分-多靶点-多通路”的复杂过程，多种成分、全方位的作用机制体现了BLRGD抗HF-LC-PLC 的中医药整体思路。但具体机制目前尚处于基础研究阶段，而网络药理学也只是基于生物信息技术对BLRGD抗HF-LC-PLC作用机制的预测。本研究后续将着手研究BLRGD与炎症微环境之间的关系，各核心成分也将在后续研究中进一步验证，阐明BLRGD抗HF-LC-PLC “多成分-多靶点”的作用机制。

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