益气养阴方对急性心肌缺血模型大鼠的保护作用

代培方，任蓁，牛雯颖，肖洪彬，刘思莹，刘欣欣，任宇婷，穆欣✉

（1. 黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

急性心肌缺血（acute myocardial ischemia，AMI）属于心血管病急症之一，是由于冠状动脉出现狭窄、堵塞导致心肌血供突然中断、心肌供血不足，使心肌细胞缺血、缺氧而引起心肌功能受损和坏死的病理状态［1-3］。数据显示，美国和欧洲地区每年分别有约240 万和400 万人的因AMI 而死亡［4］。《中国心血管健康与疾病报告2020》显示，我国心血管病负担沉重，近年来心血管病死亡连续位居中国居民总死亡原因首位，患病率和病死率呈快速上升趋势［5］，其中AMI 是关键致死因素［6］。AMI 已成为全球迫切需要解决的重大公共卫生问题之一。现代医学治疗AMI 的主要手段有药物治疗、溶栓治疗、经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）、冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass grafting，CABG）等［7］。上述方法能够快速恢复心肌血供、挽救坏死心肌组织，是早期改善临床结局的最有效的策略。然而冠状动脉再通治疗手段并不能再生和补偿心肌细胞死亡的损失，且在恢复缺血心肌血流的同时还可能会带来再灌注损伤［8］。因此，积极寻找更为有效的AMI 防治方法和药物至关重要。中医古籍并没有“心肌缺血”“心肌梗死”病名，可归于“真心痛”“胸痹”“心痛”等范畴，《黄帝内经》及现代中医临床诊疗指南均认为AMI 与气虚、血瘀、痰瘀、寒凝、气滞、气阴两虚等有关，因而临床多以益气、活血、养阴、通络等法为主进行治疗［9-10］。多项研究证实，中医药防治AMI 具有较低毒性、高生物活性的特点，对心肌缺血损伤有较好的保护作用［11-12］。但寻找更为安全有效的药物，仍是国内外医药界不懈努力的重要方向，而针对药食同源食疗方治疗AMI 的研究报道却鲜有见到。中医学素来就有“以食代养、医食同根、药食同源”的防病、治病理念，因此，利用药食同源物品研究和开发食疗方剂学有着坚实的中医学理论基础。

本课题组前期研究建立了《中药大辞典》《中医方剂大辞典》药食同源物质数据库，从中筛选出具有补气、养阴、活血作用的益气养阴方，并经过多名专家论证，确立由黄芪、葛根、西洋参、黄精、山茱萸、山药、山楂、玉竹、豆豉9 种组成益气养阴方。大量研究证实本方中的有效成分具有改善心血管功能的相关作用。为探明该方治疗心肌缺血的机制，本课题组采用结扎左冠状动脉前降支经典造模方法制备AMI 大鼠模型，通过检测分析心电图变化、血清肌酸激酶（CK）、羟丁酸脱氢酶（HBDH）、谷草转氨酶（AST）及乳酸脱氢酶（LDH）含量、心肌总超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、丙二醛（MDA）水平、心肌梗死面积等指标，对益气养阴方抗心肌缺血的作用机制进行探究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF清洁级10周龄健康雄性Wistar大鼠70只，体质量250～280 g，合格证号：SCXK（黑）2019-001，使用许可证号：SYXK（黑）2019-001。实验前大鼠予自由性饮食水，适应性喂养习惯环境1 周。实验环境：温度20～25 ℃，湿度50%～60%，每日彻底清洁消毒1次。

1.2 实验仪器、试剂与药物

仪器：MP150 多导生理记录仪（美国BIOPAC）；HX-200小动物呼吸机（成都泰盟）；KY2000半自动生化分析仪（日本岛津）。

试剂：AST试剂盒（货号：C010-1）、CK 试剂盒（货号：A032-1）、HBDH 试剂盒（货号：E005-1-1）、LDH 试剂盒（货号：A020-1）、T-SOD 试剂盒（货号：A001-1）、GSH-Px 试剂盒（货号：A005-1）、MDA 试剂盒（货号：A003-1）均购于南京建成生物工程研究所；2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色液（北京雷根生物技术有限公司）。

药物：益气养阴方中各味中药饮片均购自于黑龙江中医药大学附属第一医院，经药剂科鉴定，饮片符合2015版《中华人民共和国药典》标准。经标准煎煮流程制备后，再将药液后减压浓缩为1.1 g/mL生药，4 ℃冰箱冷藏备用，灌胃时加蒸馏水调成所需给药浓度，温服；硝苯地平控释片（10 mg/片，扬子江药业集团有限公司）；氨基甲酸乙酯（乌拉坦，天津光复精细化工研究所）。

1.3 分组及给药

按体质量随机分为7 组，分别为空白组（K 组）、假手术组（J 组）、模型组（M 组）、阳性药对照组（Y 组）和益气养阴方高、中、低剂量组（分别为G 组、Z 组和D组）。适应性喂养1周后进行灌胃给药14 d。按药理学实验方法学计算益气养阴方高、中、低剂量组的给药剂量分别为22、11、5.5 g/kg；阳性对照组给药剂量为3.7 mg/kg；正常组和模型组灌胃等量生理盐水。除空白组、假手术组外，其余各组连续给药14 d 后，第15 天行左冠状动脉前降支（left anterior descending coronary artery，LAD）结扎术制备AMI 模型，当左心室前壁出现灰白或发绀，心电图Ⅱ导联ST 段弓背样抬高≥0.1 mV时，表示造模成功［13-14］。

1.4 实验取材和指标测定

1.4.1 心电图监测

连续给药14 d 后，采用10%乌拉坦（20 mL/kg）腹腔注射麻醉后，将大鼠固定于放置恒温动物垫实验板上，按要求连接MP150 多导生理记录仪，观察并记录大鼠正常状态下心电图。LAD 结扎术造模成功后，全程密切观察心电图的动态改变并记录。选取7 个时间节点描记心电图，分别是麻醉后、结扎成功后、结扎后10 min、结扎后30 min及结扎后1、2、4、6 h。

1.4.2 血清及心肌标本采集

采用腹主动脉采血法采集大鼠动脉血标本。取血4 mL，取血后立即进行离心、分离、分装、冻存备用。各组均随机抽取3 只大鼠，取完血后迅速摘取心脏，冷盐水冲洗干净心腔残血，迅速用手术刀切去结扎线以上部分，将结扎部位与心尖部之间的心脏组织以垂直心脏纵轴方向切成3 等份，取近心尖部1/3 的心肌组织，置于-20 ℃冰箱中冻存备用。

1.4.3 TTC染色计算心肌梗死面积

取血后迅速摘取心脏，冷盐水冲洗干净心腔残血，再置于滤纸上吸干水分，盛放于无菌小培养皿并用封口膜封口，再置于-20 ℃冰箱中冻存。TTC染色步骤：①冻存取出；②心脏组织切片；③TTC 染色；④避光温育；⑤固定、观察；⑥拍照取图；⑦计算梗死面积比。观察心脏组织梗死区呈灰白色，非缺血区呈砖红色，计算心肌梗死面积比。

心肌梗死面积比= Σ 切片中苍白区面积× 厚度/Σ 切片总面积× 厚度

1.4.4 血清心肌酶的测定

血清样本取出后解冻处理，平衡至常温。用KY2000 半自动生化分析仪酶比色法测定血清肌酸激酶（CK）、羟丁酸脱氢酶（HBDH）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）及乳酸脱氢酶（LDH）活性。

1.4.5 心肌组织中抗氧化酶活力的测定

取冻存的心肌组织组织匀浆后，用ELISA 法测定GSH-Px、MDA、SOD含量水平。所有实验步骤严格按照相应试剂盒说明书进行操作。

1.5 统计学方法

实验数据结果均以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 22.0 统计软件对数据进行处理分析，组间比较采用One-way ANOVA。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠心电图的改变

大鼠LAD 结扎术造模成功后，观察其心电图可以发现，与空白组及假手术组相比较，模型组和各给药组大鼠心电图ST 段呈进行性弓背向上抬高，T 波直立高尖，呈“小红旗”样，振幅增高，提示AMI 模型构建成功；缺血30 min 达到峰值，此后振幅略下降，连续观察6 h，见图1。

图1 造模前后大鼠心电图变化

2.2 各组大鼠血清心肌酶的变化

与K 组相比，J 组血清AST、CK、HBDH 和LDH 含量变化不大，差异均无统计学意义（P＞0.05）；与K 组比较，M 组血清AST、CK、HBDH 和LDH 含量水平均明显升高（P＜0.01）；与M 组比较，Y、D、Z、G 组血清AST、CK、HBDH 和LDH 含量水平均低于模型组（P＜0.05，P＜0.01），益气养阴方各组比较无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清心肌酶含量水平比较（±s）

表1 各组大鼠血清心肌酶含量水平比较（±s）

注：与K组比较，##P ＜0.01；与M组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

组别K组J组M组Y组D组Z组G组n 10 8 9 9 8 9 9 AST（U/L）70.75±16.21 77.68±13.48 434.96±53.43##334.73±33.64**373.74±47.92*323.79±59.85**350.50±41.55**CK（U/L）302.68±37.63 347.33±53.64 656.19±86.40##475.12±75.64**555.98±62.93*499.36±80.10**501.81±89.15**HBDH（U/L）149.15±48.31 116.25±46.64 501.69±67.40##372.12±57.24**423.35±59.18*371.41±65.39**352.50±67.21**LDH（U/L）241.82±65.91 204.72±60.11 472.23±99.34##353.28±59.50*336.89±61.44*339.76±74.82*357.14±71.86*

2.3 各组大鼠心肌抗氧化酶活力水平的变化

与K 组相比，M 组大鼠心肌中SOD、GSH-Px 的活性显著降低，MDA 的活性升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与M 组相比，Y、D、Z、G 组大鼠心肌中的SOD、GSH-Px活性均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），MDA 的活性显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠心肌组织抗氧化酶活力水平的比较（±s）

表2 各组大鼠心肌组织抗氧化酶活力水平的比较（±s）

注：与K 组比较，#P ＜0.05##，P ＜0.01；与M 组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

组别K组J组M组Y组D组Z组G组n 10 8 9 9 8 9 9 SOD（U/L）269.16±30.04 270.32±35.51 215.83±26.91##266.58±28.97**255.05±31.17*260.93±26.88**253.41±24.88**GSH-Px（U/L）983.19±99.84 968.60±103.31 795.36±98.90##940.33±99.10**900.91±104.27*947.93±116.16**948.01±117.47**MDA（μmol/L）8.77±1.96 9.06±2.01 12.62±2.34##9.20±1.73**9.93±2.00*9.39±1.35**9.71±1.65**

2.4 各组大鼠心肌梗死面积的比较

K 组、J 组心肌组织的TTC 染色结果是全部砖红色，没有苍白色，表明心肌无梗死；M 组左心室的前壁和侧壁呈现大片白色，表明心肌出现大面积梗死。Y、D、Z、G组染色结果显示，左心室前、侧壁的白色面积减少，表明心肌梗死面积有所减少，见图2。与M 组（33.32 ± 3.81）%相比，Y 组（16.67 ± 1.83）%、Z 组（15.02 ± 1.70）%、G 组（14.18 ± 1.35）%显著下降（P＜0.05）。见图3。

图2 各组大鼠心肌TTC染色结果

图3 各组大鼠心肌梗死面积的比较

3 讨论

近年来，随着人们不健康生活方式日渐普遍，心血管病危险因素对居民健康的影响越加显著，我国心血管病的发病率和病死率持续增高，已成为我国居民首位死亡原因［5］，因此寻找能够降低其患病率的饮食方法显得尤为重要。在中医基础理论指导下的药食同源食疗不仅具有悠久的历史，而且临床效果显著，正契合心血管疾病的防治策略。本研究组方中黄芪、山药、西洋参性温味甘平，有补气养阴、行滞通痹的功效；玉竹、黄精性平味甘、山茱萸性微温味酸涩，三者并用取养阴固脱之功；葛根、山楂性凉味甘，有行气、活血、散瘀之功，豆豉性味苦寒，有宣郁、解毒的功效；诸药合用共奏益气养阴、活血散瘀之功。黄芪经常用于煎汤或代茶饮食疗中，取补气补虚之功；西洋参为补而不上火的滋补佳品，可切片生用，煎汤、泡饮、口含、研末冲服均可［15］；山药适于做粥食用，清代名医张锡纯用山药粥治疗多种疾病；山楂自古便是有名的“果子药”，生食、蒸煮均可，但脾胃虚弱的人不宜多食；葛根用于药膳自古有之，陶弘景云：“葛根，人皆蒸食之”［16］；山茱萸常用于食疗粥或汤佐膳，在食品加工中已应用于果酒、饮品等领域［17］；玉竹与黄精同属黄精属的代表性药食两用中药，常见于汤粥、酒方等食疗中，有益气养阴润燥之功［18］；淡豆豉药食两用历史悠久，广泛使用于多种食疗方及各类烹饪食品中［19］。

AMI 病理生理过程十分复杂，目前大量研究证实主要与氧化应激损伤、炎性反应、钙超载和细胞凋亡等密切相关。研究表明心肌缺血会导致机体氧化与抗氧化失衡，产生大量活性氧（ROS）物质，导致氧化应激损伤［20-21］。心肌酶广泛存在于心肌细胞中，大量ROS 造成细胞膜结构严重损伤，细胞膜通透性增加甚至破裂，使心肌内这些特异性酶不同程度释放入血，包括AST、CK、LDH 等［22］，可作为心肌损伤的诊断性标志物［23］。当ROS 攻破细胞抗氧化防御系统后会耗尽细胞内关键的抗氧化剂，如GSH、SOD，引起多种酶失活，抑制心肌细胞能量合成，导致Ca2+超载等，进一步加重心肌损伤。脂类物质被氧化后主要分解生成MDA，MDA又会造成细胞DNA 损伤，导致GSH-Px 及SOD 活性降低［24］。因此，以上指标的含量测定心肌细胞损伤的严重程度，有助于评价抗心肌药物的作用效果［25-26］。TTC染色可直观地观察心肌组织梗死与缺血情况。

本实验发现益气养阴方对AMI 大鼠的心肌细胞损伤具有保护作用。与模型组比较，益气养阴方低、中、高剂量组血清AST、CK、HBDH 和LDH 含量水平均低于模型组（P＜0.05）。与模型组相比，益气养阴方低、中、高剂量组心肌中的SOD、GSH-Px活性均升高，MDA 的活性降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。TTC染色结果显示，D、Z、G组大鼠左心室前壁、心尖部的苍白面积减少，表明心肌梗死面积有所减少；与模型组相比，益气养阴方中、高剂量组心肌梗死面积百分比显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。

综上实验结果，本研究发现益气养阴方能有效减轻AMI 大鼠的心肌损伤程度，抑制血清心肌酶的释放，提高心肌中抗氧化酶活性，减轻MDA 水平，从而发挥保护心肌的作用，但其作用机制还需进一步的系统实验研究进行证明。