知母多糖对甲亢热证大鼠肝脏代谢的影响

赵金椽，南洋，陈平平，刘树民

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

中药药性是对中药发挥疗效的物质基础和对病证治疗作用的高度概括［1］。但由于中药成分具有多途径、多靶点协同作用的复杂性，很难通过常规研究来诠释中药整体寒、热药性的科学内涵，这成为中药药性理论研究工作中的难点［2］。而借助现代科学技术手段，中药的药性归属有望通过动物实验以及系统生物学等方法予以科学阐释［3］。现代研究表明，寒性中药对机体基础代谢率有抑制作用，对神经系统、免疫系统、物质能量代谢系统、内分泌系统和生殖系统均可产生不同程度的影响［4］。同时，现代生物学研究认为，热证的本质是由于中枢兴奋性神经细胞的激活，启动了神经系统网络，使内分泌、免疫等系统的物质能量代谢发生不同程度的提升［5］。由于热证模型与物质能量代谢息息相关，因此通过观察寒性药物对热证模型代谢产物的干预效果，可以完善中医证候物质基础和寒性中药药性的评价方法，进一步丰富和诠释中药性味理论的科学内涵［6］。

知母是临床常用的寒性药，其药性归属已从神经、内分泌调节和物质能量代谢干预等方面被证实［7］，然而其药效发挥的具体作用机制与药性表征的核心物质基础仍有待研究。多糖是细胞表面信号识别、抗原抗体反应、细胞间信息的传递和感受的关键因子，对于具有生物活性的多糖的研究日益受到重视［8］。知母多糖（Rhizoma Anemarrhenae polysaccharide，RAPS）是知母的主要活性成分之一［9］。药理学研究显示，RAPS 具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫、降血糖等多种作用［10］。为进一步总结知母的药性归属并深入研究其药理作用，笔者观察了RAPS 对典型热证模型［11］大鼠肝脏代谢的干预作用，以期从物质能量代谢角度揭示中医热证的实质和RAPS 及知母对机体作用的内在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD 大鼠24 只，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，SPF 级，体质量（220 ± 20）g，生产许可证编号：SCXK（黑）3013-004，使用许可证号：SYXK（黑）2013-012。饲养环境温度（22 ± 2）℃，相对湿度55%～65%，9 时—21 时人工灯光照明，标准大鼠饲料喂养，自由饮水，适应性喂养1 周后用于实验。实验动物的饲养和使用经院内动物保护委员会许可。

1.2 实验药物、制备及主要试剂

知母生药材购自世一堂中药材有限公司，产地为河北安国，批号：130916；优甲乐左甲状腺素钠片（优甲乐，德国默克公司）；乙腈（色谱级，Dikma 科技公司）；甲酸（色谱级，Dikma 科技公司）；亮氨酸-脑啡肽（美国Sigma-Aldrich公司）。

RAPS 提取参照知母拆分组分制备方法［12］，将知母生药材与纯化水按照体积比1∶10 浸泡12 h 后，95 ℃回流浸提3 次，每次1 h，合并药液后，用80%乙醇过夜沉淀3 次，取上清液，旋转蒸发得浸膏，过D101 大孔树脂，经水洗脱得RAPS 水溶液，总提取率2.3%，冻干粉于4 ℃存放；用研钵将优甲乐研成细粉，纯净水溶解混匀，配成浓度为12 mg/mL 的优甲乐混悬溶液。

1.3 实验仪器

AL204 电子天平（Mettler Toledo 仪器上海有限公司）；AcquityTMUPLC 超高液相色谱仪、Premier LCT XE 型TOF-MS 质谱仪（美国Waters 公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 分组、造模、给药

将24只大鼠随机分为3组：对照组（K 组）、模型组（M 组）和RAPS 给药组（D 组），每组8 只。于每日9 时给予M 组和D 组大鼠优甲乐混悬液进行造模，优甲乐给药剂量为120 mg/kg，K 组给予等体积蒸馏水；同时于每日17 时给予D 组大鼠RAPS 24.8 mg/kg，相当于生药1 080 mg/kg（2020 版《中华人民共和国药典》中记载的临床最高日剂量生药量），K 组和M 组给予等体积蒸馏水，连续15 d。

1.4.2 肝脏样品采集

末次给药后禁食12 h，用20%乌拉坦将大鼠麻醉，于相同部位取各组大鼠肝脏，迅速置于液氮中冷冻，用预冷生理盐水制成10%肝组织匀浆。

1.4.3 代谢物分析

1.4.3.1 色谱柱

BEHC18 色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm，Waters），流动相：A 为乙腈（0.1%甲酸），B 为水（0.1%甲酸），柱温：40 ℃，进样量：2.00 μL；梯度洗脱条件见表1。

式中，Mijk为存储在第k排货架，第i列、第j行货位的货物的质量；h为货位高度；xijk为判断货位是否为空的决策变量。

表1 UPLC洗脱条件

1.4.3.2 质谱条件

质谱条件见表2。准确质量校正采用亮氨酸-脑啡肽（［M + H］+= 556.277 1，［M - H］-= 554.261 5），校正溶液进样速度为100 μL/min，校正频率为15 s，采集范围为m/z 50～1 500 Da。

表2 质谱条件

1.4.3.3 代谢组数据分析

本研究采用Progenesis QI 软件，导入代谢组数据后，对各组数据进行非监督主成分分析（PCA）和监督型主成分分析（OPLS-DA），然后选取各组变量重要性投影（VIP）＞1，组间差异P＜0.05 的代谢物。经HMDB 数据库比对，对各组所得差异代谢物进行定性，并运用MetaboAnalyst 5.0 平台［13］对代谢通路分析。

2 结果

2.1 代谢物分析

三组PCA分析结果见图1。正、负离子模式下均可见各组间明显分离，各组内高度聚集，表明各组代谢物主成分差异显著。分别将M组与K组（M/K组）、D组与M组进行比对（D/M组），得到M组与D组的显著差异代谢物，经与HMDB数据库比对后鉴定得到M/K组差异代谢物共11个，D/M组共10个，两组共有6个。见表3。

表3 组间比对差异代谢物

图1 三组PCA结果图

2.2 代谢通路分析

将M/K组和D/M 组差异代谢物分别进行代谢通路显著性分析，选择数据库代表物种为大鼠，富集分析运用超几何分布检验，拓扑学分析运用中介中心算法。代谢通路显著性分析结果见图2。两组结果均显示甘油磷脂代谢（glycerophospholipid metabolism）最为显著（P＜0.001），且磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酸（PA）同时参与此途径。进一步分析发现，M/K组结果中M 组PC 下调，PE 和PA 上调；同时，D/M 组结果中D 组PC 上调，PE 和PA 下调。可见其所引起的主要代谢通路变化为互逆过程。此外，由PC参与的亚油酸代谢（linoleic acid）在两组变化均具有统计学意义（P＜0.05）。

图2 差异代谢物通路显著性分析气泡图

3 讨论

PC、PE与PA皆为甘油磷脂代谢的核心节点，且三者可通过不同途径互相转化［14］。甘油磷脂是机体内含量最多的一类磷脂，与许多代谢类疾病相关，其异常变化是肝脏代谢异常的特征之一［15］。在肝脏，脂质通过与胆碱亲合，促进脂肪以磷脂的形式由肝脏通过血液向外输送，并增强脂肪酸在肝脏的利用，这是热证机体物质能量代谢提升的一大表现［16］。由实验结果可知，热证模型大鼠肝脏中PC 下调，PE 和PA 上调，表明PC的利用增强，向PE和PA发生了转化，并由此引发甘油磷脂代谢的异常，这也是热证的一种特征表现［2，16-17］；而给予RAPS 的大鼠PC 上调，PE 和PA 下调，逆转了此代谢通路的变化，是RAPS 药效发挥与寒性药性在代谢层面的具体体现；此外，由PC 表达量变化引起的亚油酸代谢的显著改变可知，PC 是整个代谢通路的关键节点。见图3。

图3 知母多糖对模型甘油磷脂代谢调节示意图