新疆薄皮核桃污染霉菌的分离鉴定

侯琛元，白羽嘉,*，冯作山,*，常新萍，赵 瑾

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆果品采后科学与技术重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052）

核桃常被称为胡桃，植物学分类为胡桃科核桃属[1-2]，在我国广泛种植，并成为重点发展产业之一，主要的产区大致分布在新疆、四川、云南、贵州等地。新疆是我国核桃主产区[3-4]，因独特的气候条件，适宜多种核桃种群的生长，使核桃成为促进新疆经济发展的关键产业。新疆常见的核桃品种为温138、新2、浑巴士、新巨丰、新萃丰、扎71号等，分布于阿克苏、和田、喀什等主要产区[5-6]。

近年来，核桃因口感酥脆，且含有丰富的维生素、氨基酸、不饱和脂肪酸等营养成分，成为了消费者喜爱的坚果类食品[7-8]。目前对核桃产品的贮藏是以干核桃为主，与高水分含量的鲜食核桃相比，不易出现品质劣变等问题，有更长的贮藏期[9-12]。有学者对干核桃的贮藏进行研究发现，低温条件更有利于贮藏，在防止氧化哈败现象出现的同时可减少黄酮、多酚类物质的消耗[13]。同样，有研究表明，核桃贮藏过程中最大的影响因素是温度，其次是包装材料和光照条件[14]。在核桃成熟后，由于薄皮核桃采后堆积、脱青皮、漂白、干燥等加工工序以及贮藏过程中受周围环境的湿度、温度的影响，核桃果壳开裂，极易受霉菌污染，降低产品品质，限制了其商业发展。

食品受真菌污染后一方面会造成经济损失，另一方面真菌污染产生的毒素会危害人体健康。在研究干果类食品时发现，污染食品的真菌毒素主要由黄曲霉、镰刀菌、链格孢菌等真菌的代谢物产生[15]。黄曲霉能够污染粮谷类及油料，可产生被国际癌症研究机构列为毒性较强、致癌性较强的黄曲霉毒素AFB1，造成机体生殖细胞活性降低，增加患肝病、肾病的危险[16-17]。镰刀菌主要产生单端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素[18]。链格孢菌作为果蔬及谷物的致病菌，可产生至少10种有毒代谢物，造成严重的病害[19]。镰刀菌的代谢产物可导致玉米等粮食作物的减产，同时对人体造成严重的危害[20]。通过研究发现，影响核桃仁霉烂病的病菌较多，主要有细菌、镰孢菌、青霉菌、链格孢菌和黑曲霉等[21]。目前对核桃的研究主要集中在贮藏期品质变化和贮藏技术等方面，对于污染核桃真菌的分离鉴定的研究报道较少。为此，本研究对新疆薄皮核桃中的真菌进行分离鉴定，以期为发展核桃产业，解决核桃在贮藏、运输期间品质劣变等问题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

核桃品种为新2，采自新疆阿克苏地区温宿县。

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、孟加拉红琼脂培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；无水乙醇（分析纯），西安天茂化工有限公司；真菌DNA提取试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；乳酸酚棉蓝染色液，山东伊兰博化玻仪器有限公司。

1.1.2 仪器与设备

LDZX-30KBS型立式不锈钢蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；FA10024B型电子天平，博科BIOBASE公司；SW-CJ-1F型超净工作台，上海跃进医疗器械厂；3730XL型测序仪，美国ABI公司；FR980型凝胶成像仪，上海复日科技仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

挑选出100个表面发霉的带壳核桃，用75%的酒精擦拭核桃壳表面，浸入装有无菌水的无菌袋中浸泡12 h，取出沥干后，分装至无菌袋中于28℃恒温培养箱中培养5 d。

1.2.2 优势菌群分析

统计薄皮核桃霉菌发生情况，并采用涂布法、划线法对核桃优势菌株进行分离保藏。

1.2.3 薄皮核桃污染霉菌的分离纯化

将样品置于超净工作台中，破壳选取不同程度发霉的核桃仁25 g，放入含有225 mL无菌水的锥形瓶中混匀，制成稀释梯度为10-1、10-2、10-3的悬浮液，分别涂抹于PDA、孟加拉红培养基中，于28℃恒温培养观察，待长出菌落后，采用三点法再次接种于PDA、孟加拉红培养基中，从培养基上无其他杂菌开始，继续在28℃纯化培养3代，于4℃保存，用于后续试验。

1.2.4 真菌菌落生长直径变化

采用点值法将所分离霉菌接种在PDA培养基上，每天观察记录菌落直径变化情况。通过每天测量菌株生长直径，计算该菌株直径平均生长速率。

式中：Ln为菌株生长n天的直径，cm；t为菌株生长的天数，d。

1.2.5 薄皮核桃污染霉菌的形态学鉴定

对纯化菌株经传统形态学法进行鉴定：采用点值法挑选较纯的菌落接种于PDA培养基上，培养5～7 d，每次做5个重复，每天用肉眼观察并记录菌落的生长特征，测量直径变化。霉菌的生长变化主要有形态、色泽、菌落直径、厚度等特征。

挑出少量纯化的菌丝制片，先经高倍显微镜观察具体形态，再通过查找《真菌鉴定手册》[22]和《中国真菌志》[23]对菌株的描述来确定菌株种属。

1.2.6 真菌组DNA的提取

将分离菌株于28℃恒温培养7 d后，收集菌丝体经液氮研磨，放入离心管中，参照SK8259真菌DNA提取试剂盒说明进行相关操作提取菌株DNA。

1.2.7 真菌ITS区PCR扩增及序列测定

ITS通用扩增引物ITS1为5’-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3’；ITS4为5’-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3’。引物由生工生物工程股份有限公司合成，经琼脂糖凝胶电泳（150 V，100 mA）检测扩增产物，再送生工生物工程（上海）服务有限公司测序。

1.2.8 系统发育树的构建

ITS测序序列：由NCBI网站中的BLAST在线进行比对，获得亲缘性高的基因序列，通过MEGA 6.0软件，使用N-J法对亲缘性较高的序列和目的基因建立进化树，采用自举法检验，重复1000次，确定真菌种属。

2 结果与分析

2.1 薄皮核桃污染霉菌的分离纯化

以薄皮核桃为原料，采用稀释梯度为10-1、10-2、10-3的悬浮液，分离出霉菌于PDA培养基上纯化得到米根霉、深绿木霉、扩展青霉、黑曲霉、黄曲霉、腐皮镰刀菌、拟轮枝镰刀菌、红贝俄氏孔菌、歧皱青霉、交链格孢菌10株主要菌株，编号HT001～HT010。

2.2 薄皮核桃污染霉菌的优势菌群分析

为验证薄皮核桃污染霉菌的优势菌株，对100个霉变的核桃放置5 d后进行观察，霉菌发生率100%（表1）；其中菌株HT001、HT002、HT004和HT005在核桃上的发生率分别达到29%、19%、25%和21%，而其他菌株的发生率都低于10%。可见污染核桃的优势霉菌分别为HT001、HT002、HT004和HT005菌株，对优势菌株进行分离纯化，于4℃保存，用于进一步形态和分子生物学鉴定。

表1 薄皮核桃污染霉菌发生率Table 1 The incidence of mold contamination in thin-skinned walnuts

2.3 薄皮核桃分离霉菌的菌落生长直径测定

表2为新疆薄皮核桃中分离出的10株霉菌菌落生长直径变化情况，采用点值法将霉菌接种在PDA培养基上。可以看出，HT001和HT002菌株较其他菌株生长快，平均生长速率达到2.615 cm/d和2.719 cm/d,分别在第4天和第5天时长满整个培养基；HT004和HT005两株菌株的平均生长速率达到1.139 cm/d和1.100 cm/d，菌落生长速率高于其他菌株（除HT001、HT002）；HT003、HT009两株菌株平均生长速率分别为0.502 cm/d和0.415 cm/d，且菌落生长速率始终低于其他菌株。

表2 核桃分离霉菌菌落生长直径Table 2 Growth diameter of mold colony isolated fromthin-skinned walnuts 单位：cm

2.4 薄皮核桃污染霉菌的形态学鉴定

将薄皮核桃中所分离出的10株霉菌于PDA培养基上培养观察。如图1所示，HT001菌株于28℃恒温培养至3 d后，菌落铺满整个培养基表面，正面呈现絮状白色气生菌丝，不规则，生长较快，后期菌丝着生黑色圆点孢子，背面呈乳白色。分生孢子为不规则卵圆形，孢子梗细长光滑，顶端聚集为球形孢子囊。依据菌落生长情况、分生孢子等形态特征，鉴定HT001为根霉属（Rhizopussp.）真菌。

图1 菌株HT001孢子及菌落形态Fig.1 Spore and colony morphology of strain HT001

如图2所示，HT002菌株于28℃恒温培养5 d后，菌落铺满整个培养基表面，正面呈现白绿色菌丝，环状分布，前期为白色，培养第4天时培养基中心转变为绿色菌落，整体菌落加厚，背面呈现黄色。分生孢子为卵圆状单个细胞，数量众多，表面光滑紧密连接成团状，并附着于细长的菌丝上。依据菌落生长情况、分生孢子等形态特征，鉴定HT002为木霉属（Trichodermasp.）真菌。

图2 菌株HT002孢子及菌落形态Fig.2 Spore and colony morphology of strain HT002

如图3所示，HT003菌株于28℃恒温培养5 d后，菌落直径25 mm，散射状沟纹，表面粗糙具有颗粒感，初期正面为白色、圆形，并逐渐转变为深青色，周边为白色绒状，背面淡黄色。着生在孢子梗上的分生孢子为不平整的圆球形的链状排布，整体呈扫帚形态。依据菌落生长情况、分生孢子等形态特征，鉴定HT003为青霉属（Penicilliumsp.）真菌。

图3 菌株HT003孢子及菌落形态Fig.3 Spore and colony morphology of strain HT003

如图4所示，HT004菌株于28℃恒温培养5 d后，菌落直径60 mm，正面呈现黑色绒状菌丝，表面粗糙，产生较多的分生孢子，表面沟壑状，周边长有稀疏的不规则白色菌丝，背面呈乳白色。圆球形孢子，体积小，孢子梗壁光滑，顶囊产孢区表面有分生孢子着生并形成簇状聚集。依据菌落生长情况、分生孢子等形态特征，鉴定HT004为曲霉属（Aspergillussp.）真菌。

图4 菌株HT004孢子及菌落形态Fig.4 Spore and colony morphology of strain HT004

如图5所示，HT005菌株于28℃恒温培养5 d后，菌落直径57 mm，正面呈黄绿色绒状菌丝，表面粗糙，散发状沟纹，可见清晰的圈带，中心菌落低凸起为黄色，颜色不断加深，菌落外环为白色，后期转变为草绿色，背面为黄色。分生孢子为不规则球状，孢子通过表面顶囊小梗串生。依据菌落生长情况、分生孢子等形态特征，鉴定HT005为曲霉属（Aspergillussp.）真菌。

图5 菌株HT005孢子及菌落形态Fig.5 Spore and colony morphology of strain HT005

如图6所示，HT006菌株于28℃恒温培养5 d后，菌落直径50 mm，正面呈白色绒毛状，菌表近似紫红色，中心菌落低凸起，背面呈黄褐色。分生孢子为卵圆形，较长，孢子量较多，菌丝有间隔，细长，分生孢子聚集在菌丝周围。依据菌落生长情况、分生孢子等形态特征，鉴定HT006为镰刀菌属（Fusariumsp.）真菌。

图6 菌株HT006孢子及菌落形态Fig.6 Spore and colony morphology of strain HT006

如图7所示，HT007菌株于28℃恒温培养5 d后，菌落直径51 mm，正面呈浅薄的白色气生菌丝，表面平整，前期为粉红色，转为白色，中心菌落低凸起，背面黄色。分生孢子梗有分枝，生长缓慢，分布散落，多聚集丛生在小梗顶端。依据菌落生长情况、分生孢子等形态特征，鉴定HT007为镰刀菌属（Fusariumsp.）真菌。

图7 菌株HT007孢子及菌落形态Fig.7 Spore and colony morphology of strain HT007

如图8所示，HT008菌株于28℃恒温培养5 d后，菌落直径49 mm。正面近似白色，中心菌落偏暗黄色，菌表平滑，无褶皱，反面为淡褐色。分生孢子为长椭圆形，丛生，菌丝光滑较细长，相互缠绕生长。依据菌落生长情况、分生孢子等形态特征，鉴定HT008为春孔菌属（Earliellasp.）真菌。

图8 菌株HT008孢子及菌落形态Fig.8 Spore and colony morphology of strain HT008

如图9所示，HT009菌株于28℃恒温培养5 d后，菌落直径20 mm，正面呈浅青色，周边白色环状，表面不平整，褶皱严重，中心菌落高凸起，背面呈暗褐色。分生孢子近似圆形，表面不平整，菌丝偏平，分枝较多，孢子着生于表面。依据菌落生长情况、分生孢子等形态特征，鉴定HT009为青霉属（Penicilliumsp.）真菌。

图9 菌株HT009孢子及菌落形态Fig.9 Sporeand colony morphology of strain HT009

如图10所示，HT010菌株于28℃恒温培养5 d后，菌落直径52 mm，正面暗黄色，较厚，菌落环状分布，中心菌落低凹，深褐色，外环呈白色绒状，背面呈红棕色。分生孢子为长形，棍状，链状排列，并分布于菌丝中间，菌丝光滑，较细。依据菌落生长情况、分生孢子等形态特征，鉴定HT010为链格孢属（Alternariasp.）真菌。

图10 菌株HT010孢子及菌落形态Fig.10 Spore and colony morphology of strain HT010

2.5 薄皮核桃污染霉菌的分子生物学鉴定

2.5.1 真菌基因组DNA提取

采用试剂盒法对分离真菌的基因组DNA进行提取，薄皮核桃污染霉菌的基因组DNA电泳图如图11所示，10株真菌的DNA片段长度符合基因组DNA长度大小，均在15 000 bp以上。

图11 薄皮核桃真菌基因组DNA电泳图Fig.11 Genomic DNA electrophoresismap of thin-skinned walnut fungus

2.5.2 真菌ITS序列分析

以ITS1和ITS4为引物，以分离污染霉菌的DNA为模板，进行PCR扩增，结果如图12所示。从薄皮核桃污染霉菌中分离出的10株菌株得到相应的DNA片段，大小在500～700 bp，产物条带单一，浓度高，符合真菌ITS序列条带。

图12 薄皮核桃真菌ITS序列的PCR扩增电泳图Fig.12 The ITSsequence and PCRamplification electrophoresis of thin-skinned walnut fungus

为进一步确定污染霉菌的种类，将得到的PCR产物进行序列测定，结果表明，菌株通过PCR扩增得到序列如下：菌株HT001～HT010分别为557、589、564、572、567、547、528、546、562、547 bp，与PCR扩增电泳图条带长度一致。测序后，运用MEGA 6.0软件的N-J法进行数据分析，并构建该菌株的系统发育树。

图14 菌株HT002的ITS序列系统发育树Fig.14 ITSsequence phylogenetic tree of strain HT002

图16 菌株HT004的ITS序列系统发育树Fig.16 ITSsequence phylogenetic tree of strain HT004

图17 菌株HT005的ITS序列系统发育树Fig.17 ITSsequencephylogenetic treeof strain HT005

图18 菌株HT006的ITS序列系统发育树Fig.18 ITSsequence phylogenetic tree of strain HT006

图19 菌株HT007的ITS序列系统发育树Fig.19 ITSsequence phylogenetic tree of strain HT007

图20 菌株HT008的ITS序列系统发育树Fig.20 ITSsequencephylogenetic treeof strain HT008

图21 菌株HT009的ITS序列系统发育树Fig.21 ITSsequencephylogenetic treeof strain HT009

图22 菌株HT010的ITS序列系统发育树Fig.22 ITSsequence phylogenetic treeof strain HT010

根据构建的系统发育树（图13～22）可知，菌株HT001与MW757227.1Rhizopusoryzae遗传距离最近，菌株HT002与MT341775.1Trichodermaatroviride遗传距离最近，菌株HT003与MT582774.1Penicillium expansum遗传距离最近，菌株HT004与MG228419.1Aspergillusniger遗传距离最近，菌株HT005与MW092907.1Aspergillusflavus遗传距离最近，菌株HT006与KX379161.1Fusariumsolani遗传距离最近，菌株HT007与MT180471.1Fusariumverticillioides遗传距离最近，菌株HT008与MF077240.1Earliella scabrosa遗传距离最近，菌株HT009与MF077228.1Penicilliumdierckxii遗传距离最近，菌株HT010与MK968042.1Alternariaalternata遗传距离最近。

根据形态学观察和ITS结果进行分析，菌株HT001为米根霉（Rhizopusoryzae），菌株HT002为深绿木霉（Trichodermaatroviride），菌株HT003为扩展青霉（Penicilliumexpansum），菌株HT004为黑曲霉（Aspergillusniger），菌株HT005为黄曲霉（Aspergillus flavus），菌株HT006为腐皮镰刀菌（Fusariumsolani），菌株HT007为拟轮枝镰刀菌（Fusariumverticillioides），菌株HT008为红贝俄氏孔菌（Earliellascabrosa），菌株HT009为歧皱青霉（Penicilliumdierckxii），菌株HT010为交链格孢菌（Alternariaalternata）。

3 讨论与结论

本研究以新疆薄皮核桃为原料，经形态学观察和ITS分子生物学鉴定，从试验原料中共分离出10株污染真菌，所获得的ITS序列均能从NCBI数据库中找到同源性达到98%的对应序列，再经分析比对同源性较高的序列与已知序列的遗传距离，从而明确该菌株的种属。本文从薄皮核桃中共分离出10株真菌，结合霉菌菌落在培养基上生长直径变化情况和接种核桃时霉菌的发生率研究发现：米根霉（Rhizopus oryzae）、深绿木霉（Trichodermaatroviride）、黑曲霉（Aspergillusniger）和黄曲霉（Aspergillusflavus）这4种菌株在适宜条件下生长速率高于其他菌株，是影响核桃品质变化的优势霉菌；其他6种霉菌分别是扩展青霉（Penicilliumexpansum）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）、拟轮枝镰刀菌（Fusariumverticillioides）、红贝俄氏孔菌（Earliellascabrosa）、歧皱青霉（Penicillium dierckxii）、交链格孢菌（Alternariaalternata）。

国内对核桃霉变病原菌的研究较少，李亚婷[24]对霉变鲜核桃仁的霉菌进行鉴定，得到优势霉菌为总状毛霉、黑曲霉、黄曲霉和桔青霉。李勇鹏等[25]对云南鲜食核桃在低温贮藏中腐烂病进行研究发现，扩展青霉是影响鲜食核桃品质的主要病菌，扩展青霉会产生展青霉素，若食用含有展青霉素的食品会造成机体细胞衰老、畸形，肾脏损伤，甚至引发癌症等[26]。耿阳阳等[27]将引起贵州纸皮核桃霉烂的病原菌鉴定为黑曲霉、黄曲霉、腐皮镰刀菌和卷枝毛霉。黄凯等[28]通过形态学鉴定结果分析，得出影响鲜食核桃贮藏的病原菌主要为扩展青霉。综上所述，影响不同地区核桃品质变化的霉菌种类和数量有所不同，这与核桃在不同的生长、贮藏环境中接触到不同种类病原菌有关。

核桃污染霉菌后所造成的发霉、腐败变质是由多种真菌协同污染的结果。污染霉菌来源有两方面：一是由于脱皮加工过程中病菌的寄生，二是受贮藏条件的影响，环境湿度高更容易滋生霉菌。实际生产中应对核桃的采摘、运输、贮藏等方面进行严格把控，包括对核桃脱青皮等加工工序的改良，防止二次污染。