草珊瑚乙醇提取物的抗氧化性及其对芒果采后主要病原菌的抑菌活性研究

童 悦，徐祥彬，史学群,*，李江阔

（1.海南大学食品科学与工程学院，海南 海口 570228；2.天津市农业科学院农产品保鲜与加工技术研究所（国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津）），农业农村部农产品贮藏保鲜重点实验室，天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津 300384）

蒂腐病和炭疽病均为芒果果实采后常见病害，其中，炭疽病主要由芒果胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起，蒂腐病由芒果拟茎点霉蒂腐菌（Phomopsismangiferae）、可可球二孢蒂腐菌（Botryodiplodiatheobromae）及小穴壳蒂腐菌（Dothiorelladominicana）等病原菌引起[1]，其中又以可可球二孢蒂腐菌、拟茎点霉蒂腐菌侵染最为严重[2]。目前常见的防治措施为喷洒多菌灵、施保克、咪鲜胺、扑海因、施保功等化学杀菌剂[3]，但大量施用杀菌剂可能导致病原菌产生耐药性而减弱杀菌效果，同时存在杀菌剂残留量超标等弊端[4]。近年来，植物提取物由于具有良好的抑菌活性及安全、无毒、高效等特点而逐渐受到国内外研究者的关注。例如：苏子寒等[5]报道了16种植物源活性成分对胶孢炭疽菌等芒果采后病原菌的抑菌活性及对果实病害的防治效果，发现荜茇酰胺具有优于化学杀菌剂咪鲜胺的抑菌效果，极具开发潜力；Zhang等[6]从中药材土荆皮的乙醇提取液中分离到了8种对胶孢炭疽菌有抑菌活性的化合物，其中两种对胶孢炭疽菌分生孢子的萌发及芽管伸长有显著的抑制作用；Akhtar等[7]对61种药用植物提取液的抑菌活性进行了筛选，发现其中6种植物提取物具有广谱抗菌性，两种对曲霉属真菌表现出明显的抗菌活性；Mahlo等[8]制备了原产于南非的6种植物的甲醇、丙酮、二氯甲烷提取物，并测定了这些提取物对黑曲霉、尖孢镰刀菌、扩展青霉等7种病原真菌的抑制作用，结果表明6种植物的提取物对7种病原真菌均表现出一定的抑菌活性；ˇSvecová等[9]研究发现，浓度为0.2%的穗花牡荆提取物即可有效抑制番茄腐霉的菌丝生长；程慧丽等[10]研究了八角提取物对20种植物病原菌的室内抑菌效果，发现1 mg/mL八角提取物对辣椒灰霉菌、番茄灰霉菌有较好的抑菌效果，抑制率均高于96%。

草珊瑚（Sarcandraglabra）又名肿节风、九节茶、九节风等，资源较丰富，主要分布于云南、贵州、福建、江西、海南等地[11]。草珊瑚在民间应用广泛，具有清热

解毒、祛风除湿、活血祛瘀、通经接骨等功效[12]。经现代化学分析技术研究发现，其提取物主要含有萜类、黄酮类、香豆素、酚酸类等类别的组分[13]。近年来，已有不同研究证实草珊瑚植株中所含的活性成分具有抗氧化[14-15]、抑制致病细菌[16]、抗真菌[17]、抗肿瘤[18-20]、抗感染[21]、抗病毒[22]等作用，但研究内容均基于草珊瑚中草药药理、临床应用等方面，针对果蔬采后保鲜或采后果实病原微生物防治方面的报道极少。本试验选取产自海南省琼中县的草珊瑚全草，以无水乙醇为溶剂制备提取物，并对提取物的抗氧化性进行初步评价，研究了不同浓度草珊瑚提取物对芒果采后常见病原菌的抑菌活性、最小抑菌浓度、孢子萌发率等指标的影响，以期为草珊瑚提取物在芒果果实采后保鲜、病害防治方面的应用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

草珊瑚（Sarcandraglabra）全草，采集自海南省琼中黎族苗族自治县吊罗山乡，运回实验室，洗净并自然晾干，放入烘箱45℃烘干6 h[23]，粉碎并过100目标准筛，备用。

胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）、芒果可可球二孢蒂腐菌（Botryodiplodiatheobromae）、芒果拟茎点霉蒂腐菌（Phomopsismangiferae）均由海南大学食品科学与工程学院采后病理学实验室提供。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH），购于上海源叶生物科技有限公司；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2ˊ-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS），购于上海生工生物工程有限公司；没食子酸、芦丁，购于上海麦克林生化科技有限公司；福林酚试剂，购于索莱宝科技有限公司。其余试剂均为市售分析纯。

1.1.2 仪器与设备

RV10型旋转蒸发仪，德国IKA公司；UVmini-1240紫外可见光分光光度计，上海一恒科学仪器有限公司；THZ-82型恒温气控摇床，常州国华电器有限公司；YXQ-LS-70A立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司；SDPTOPE5光学显微镜，宁波舜宇仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

称取草珊瑚全草粉末以双层滤纸包裹，按照料液比1∶16（g/mL）向圆底烧瓶中加入无水乙醇，用索氏提取装置抽提6 h，收集提取液，用旋转蒸发仪除去乙醇，获得草珊瑚提取物浓缩浸膏。称取35 g浸膏，溶于35 mL 50%乙醇溶液中，配制成浓度为1 g/mL的提取物母液，密封保存于4℃冰箱中备用[24]。

1.2.2 草珊瑚乙醇提取物总酚含量的测定

采用Jin等[25]的方法测定。每个浓度设3个平行，结果取平均值。以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，拟合方程。配制1 mg/mL的草珊瑚乙醇提取物稀释液，按相同步骤完成反应，并测定吸光度，重复3次，根据没食子酸标准曲线换算提取物中总酚含量。

1.2.3 草珊瑚乙醇提取物总黄酮含量的测定

采用氯化铝比色法[26]测定。每个浓度设3个平行，结果取平均值。配制1 mg/mL的草珊瑚乙醇提取物稀释液，按相同步骤完成反应并测定吸光度，重复3次，根据芦丁标准曲线换算提取物中的总黄酮含量。

1.2.4 草珊瑚乙醇提取物对DPPH自由基的清除能力测定

参照Das等[27]的方法测定。以无水乙醇为空白对照，以2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）为阳性对照，设置5个浓度（1、10、100、1 000、10 000μg/mL）梯度，每个浓度均设3个平行，反应后于517 nm处测定吸光度。按照下式计算DPPH自由基清除率。

式中：A0为空白对照管的吸光度；As为样品液与DPPH反应后的吸光度；Ax为以等量无水乙醇取代DPPH测得的吸光度。

1.2.5 草珊瑚乙醇提取物对ABTS自由基的清除能力测定

参照Da Silva等[28]的方法测定。以无水乙醇为空白对照，以BHT为阳性对照，设置5个浓度（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mg/mL）梯度，每个浓度均设置3个平行。依照下式计算ABTS自由基清除率。

式中：A0为空白对照管的吸光度；As为样品液与ABTS反应后的吸光度；Ax为以等量无水乙醇取代ABTS测得的吸光值。

1.2.6 草珊瑚提取物对芒果采后主要病原菌的抑制活性测定

采用菌丝生长速率法[29]进行测定。取灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，熔化后待温度降至50℃左右，加入草珊瑚提取物稀释液并使最终浓度分别为0.625、1.25、2.50、5.00 mg/mL，混匀后制成含提取物的平板。用灭菌的5 mm打孔器在经活化的菌株上打孔，取菌饼，菌丝向下接种于含提取物平板的中心。以无菌水配制的PDA培养基为空白对照，重复3次。置于25℃恒温培养箱内培养7d，每24h进行观察拍照，采用十字交叉法测量菌落直径（mm），依据下式计算抑制率。

1.2.7 草珊瑚提取物对芒果主要病原菌的最小抑菌浓度（MIC）测定

菌悬液的制备：在活化后的3种病原菌菌丝表面滴加少量无菌水，用无菌的涂布棒刮取菌苔，过滤后得到菌悬液，利用血球计数板将最终浓度调节至106CFU/mL。

向50、49、48、46 mL熔化的PDA培养基中分别加入0、1、2、4 mL的500 mg/mL草珊瑚提取物稀释液，然后用50%乙醇定容至50 mL，使最终浓度分别为0、10、20、40 mg/mL，混匀后制成含提取物的平板。在表面滴加20μL菌悬液，快速涂布均匀，密封置于25℃恒温培养箱内培养3 d，以无菌落生长的最低提取物浓度为MIC[30]；持续培养7 d，以始终无菌落生长的最低提取物浓度为最小杀菌浓度（MBC）。

1.2.8 草珊瑚提取物对芒果采后主要病原菌的孢子萌发抑制作用测定

孢子液的制备：将活化后的C.gloeosporioides、B.theobromae分别接种至马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）培养基中，于25℃、180 r/min空气摇床中培养2～4 d，滤除菌丝，将滤液以3 000 r/min离心10 min，弃上清后加入少量无菌水，制得孢子悬浮液，在显微镜下观察并调节其最终浓度至106个/mL。

将定量的孢子悬浮液、PDB培养基和不同浓度的草珊瑚乙醇提取物加入1.5 mL无菌离心管中，使提取物终浓度分别为0、0.625、1.25、2.5、5 mg/mL。取100μL混合液均匀涂于载玻片上，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，于（25±1）℃环境下恒温培养。以孢子芽管长度超过孢子宽度时作为萌发的标准，分别于4、6、8、10、12 h用显微镜观察并统计不少于100个孢子的萌发情况[31]。每个处理均设置3个平行，试验重复3次。

1.2.9 数据处理

试验数据统计分析采用Excel、SPSS 19.0等软件，采用Duncan新复极差法比较各组间数据差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 草珊瑚乙醇提取物中的总酚和总黄酮含量

将提取物样品的吸光度平均值代入回归方程y=10.217x-0.110 7（图1A），可得1 mg/mL草珊瑚乙醇提取物中总酚含量相当于等体积的0.076 2 mg/mL没食子酸，即草珊瑚乙醇提取物中总酚含量为7.62%。将对应的样品稀释液吸光度平均值代入芦丁标准曲线回归方程y=8.935x+0.054 4（图1B），可得1 mg/mL草珊瑚乙醇提取物中总黄酮含量相当于等体积的0.061 3 mg/mL芦丁，即草珊瑚乙醇提取物中总黄酮含量为6.13%。

图1 没食子酸标准曲线（A）和芦丁标准曲线（B）Fig.1 Standard curveof gallic acid(A)and rutin(B)

2.2 草珊瑚乙醇提取物对DPPH自由基的清除能力

DPPH的无水乙醇溶液呈紫色至紫黑色，向DPPH溶液中加入自由基清除剂如BHT后，DPPH自由基中的孤对电子被配对，反应体系呈现的颜色变浅，在517 nm处的吸光度减小且与配对电子数呈剂量关系。因此，通过该方法可测定草珊瑚乙醇提取物对DPPH自由基的清除能力。由图2可见，草珊瑚乙醇提取物对DPPH自由基确实具有清除作用，且随着浓度的增加清除作用增大。当BHT浓度为1μg/mL时，其对DPPH自由基的清除率为2.87%；而相同浓度的草珊瑚提取物稀释液对DPPH自由基的清除率为7.09%。此后随着浓度的提高，对照BHT与样品草珊瑚提取物对DPPH自由基的清除率均逐渐增强，但草珊瑚提取物对DPPH自由基的清除效果始终弱于等浓度的BHT溶液。

图2 BHT及草珊瑚乙醇提取物对DPPH自由基的清除作用Fig.2 Thescavengingeffect of BHTand S.glabra ethanol extract on DPPH·

2.3 草珊瑚乙醇提取物对ABTS自由基的清除能力

ABTS与过硫酸钾混合反应后可生成稳定的蓝绿色阳离子自由基体系，当加入具有抗氧化性的物质，并调节至碱性环境，ABTS会与抗氧化物质发生反应而使体系褪色，在734 nm处测定反应前后吸光度的变化即可计算出样品的对ABTS自由基的清除能力。由图3可知，草珊瑚乙醇提取物和BHT对ABTS自由基均具有清除作用，但草珊瑚乙醇提取物的清除作用总体弱于BHT。草珊瑚乙醇提取物在浓度为0.625 mg/mL时，对ABTS自由基的清除率仅为26.61%，而同浓度BHT对ABTS自由基的清除率已达到71.16%；当浓度升至1.25 mg/mL时，草珊瑚乙醇提取物对ABTS自由基的清除率升至45.69%，此时BHT对ABTS自由基清除率为83.68%。当浓度为10 mg/mL时，BHT与草珊瑚提取物对ABTS自由基的清除率均超过90%，逐渐接近。

图3 BHT及草珊瑚乙醇提取物对ABTS自由基的清除作用Fig.3 The scavenging effect of BHTand S.glabra ethanol extract on ABTS+·

2.4 草珊瑚乙醇提取物对芒果采后主要病原菌的抑制活性

2.4.1 草珊瑚乙醇提取物对芒果胶孢炭疽菌的抑制作用

由图4可知，草珊瑚乙醇提取物对芒果胶孢炭疽菌的菌丝生长有显著的抑制作用，抑菌效果随浓度提高而增强，低浓度处理与高浓度处理间差异显著（P＜0.05）。培养至第7天，对照组菌落平均直径达84.25 mm，0.625 mg/mL处理组、1.25 mg/mL处理组菌落平均直径较为接近，分别为70.38、69.38 mm，抑制率分别为17.82%、18.59%；2.50 mg/mL处理组和5.00 mg/mL处理组的抑制率分别为38.97%、41.25%。

图4 草珊瑚乙醇提取物对芒果胶孢炭疽菌的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of S.glabra ethanol extract on C.gloeosporioides

2.4.2 草珊瑚乙醇提取物对芒果拟茎点霉蒂腐菌的抑制作用

由图5可知，草珊瑚乙醇提取物对拟茎点霉蒂腐菌的菌丝生长有较好的抑制作用，不同浓度间差异显著（P＜0.05）。在0.625～5.00 mg/mL的梯度范围内，抑菌效果最佳的处理剂量为2.50 mg/mL。培养1 d后，对照组菌落直径已达20.13 mm，而1.25、2.50、5.00 mg/mL处理组菌落均未扩展；培养至第7天，对照组的菌丝已经扩展至整个培养皿，2.50 mg/mL处理组菌落平均直径仅有46.75 mm，抑制率为50.29%。

图5 草珊瑚乙醇提取物对拟茎点霉蒂腐菌的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of S.glabra ethanol extract on P.mangiferae

2.4.3 草珊瑚乙醇提取物对可可球二孢蒂腐菌的抑制作用

由图6可知，草珊瑚乙醇提取物对可可球二孢蒂腐菌菌丝生长的抑制作用相对较弱，抑制率随培养时间的延长而逐渐降低。在0.625～5.00 mg/mL的梯度范围内，抑菌效果最佳的处理剂量为5.00 mg/mL。培养至第5天，0.625 mg/mL处理组菌落直径达90 mm，失去抑制作用；第6天，仅5.00 mg/mL处理仍能够保持一定的抑制作用，抑制率为10.67%。

图6 草珊瑚乙醇提取物对可可球二孢蒂腐菌的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of S.glabra ethanol extract on B.theobromae

2.5 草珊瑚提取物对芒果主要病原菌的最小抑菌浓度

由表1和表2可见，不同菌种对相同浓度的草珊瑚提取物的敏感程度不同。胶孢炭疽菌、拟茎点霉蒂腐菌培养至3 d时在10 mg/mL及以上浓度均无生长，因此胶孢炭疽菌、拟茎点霉蒂腐菌的MIC均为10 mg/mL；培养至10 d时，两者仅在40 mg/mL处理组仍无菌落生长，故可认为胶孢炭疽菌、拟茎点霉蒂腐菌MBC均为40 mg/mL。可可球二孢蒂腐菌MIC为20 mg/mL，而培养至10 d时，各浓度处理组均有可可球二孢蒂腐的菌落生长，故本次筛选范围内未获得其MBC。

表1 草珊瑚提取物对芒果采后病原菌的MIC测定Table 1 Determination of MICof S.glabra ethanol extract against postharvest mango pathogens

表2 草珊瑚提取物对芒果采后病原菌的MBC测定Table2 Determination of MBCof S.glabra ethanol extract against postharvest mangopathogens

2.6 草珊瑚提取物对胶孢炭疽菌和可可球二孢蒂腐菌孢子萌发的抑制作用

由图7可见，不同浓度草珊瑚乙醇提取物对胶孢炭疽菌和可可球二孢蒂腐菌孢子的萌发均有抑制或延缓的作用。5.00 mg/mL草珊瑚提取物可在6 h内完全抑制胶孢炭疽菌孢子的萌发；至12 h，对照组孢子完全萌发，5.00 mg/mL处理组孢子萌发率仅36.67%。草珊瑚提取物对可可球二孢蒂腐菌孢子萌发的抑制作用相对较弱，5.00 mg/mL处理组在培养4 h已开始萌发，至8 h萌发率已达30.33%。

图7 草珊瑚乙醇提取物处理对胶孢炭疽菌（A）和可可球二孢蒂腐菌（B）孢子萌发的影响Fig.7 Effects of S.glabra ethanol extract on spore germination of C.gloeosporioides(A)and B.theobromae(B)

3 结论与讨论

上述试验结果表明：草珊瑚全草乙醇提取物中的总酚含量为7.62%，总黄酮含量为6.13%；在低浓度（1μg/mL）下，草珊瑚乙醇提取物对DPPH自由基的清除能力优于BHT，但随着浓度的升高，BHT对DPPH自由基的清除能力逐渐优于提取物；草珊瑚乙醇提取物对ABTS自由基的清除能力弱于同浓度BHT溶液，但抗氧化性随浓度的升高增强更为明显；草珊瑚乙醇提取物浓度为0.625 mg/mL时，对ABTS自由基的清除率仅为26.61%；当浓度提高至1.25mg/mL时，提取物对ABTS的清除率可提升至45.69%；当浓度提高到10 mg/mL时，草珊瑚提取物对ABTS的清除率超过90%。说明草珊瑚乙醇提取物对DPPH自由基和ABTS自由基均具有良好的清除作用，具有潜在的抗氧化能力。

草珊瑚乙醇提取物对芒果采后常见病原菌均有一定的抑制作用，其中对拟茎点霉蒂腐菌的抑制作用最佳，在筛选范围内最优浓度为2.50 mg/mL，培养7 d时抑制率仍保持在50.29%。草珊瑚乙醇提取物对胶孢炭疽菌菌丝生长与孢子萌发均有较好的抑制作用，5.00 mg/mL草珊瑚乙醇提取物可有效抑制其菌落扩展，并将12 h内孢子萌发率控制在40%以下。草珊瑚提取物对以上两种芒果采后病原菌均具有良好的抑菌活性，后续试验将着眼于草珊瑚提取物对采后芒果果实的病害防治效果与草珊瑚提取物的抑菌机理方面，如进一步分离鉴定其中的单体化合物成分，有望为开发用于芒果采后保鲜的天然抗氧化剂、抗菌剂提供理论基础。

草珊瑚乙醇提取物对可可球二孢蒂腐菌的抑制作用较弱，5.00 mg/mL处理组菌丝生长仍较旺盛，培养至第6天时抑制率仅有10.67%，至第7天菌丝完全布满培养基表面，最小抑菌浓度为20 mg/mL；同时，5.00 mg/mL处理组的孢子在培养4 h已开始萌发，至8 h萌发率达30.33%。在MBC筛选过程中发现：40 mg/mL草珊瑚提取物依然无法完全抑制可可球二孢蒂腐菌的生长，需要考虑继续扩大筛选范围、提高提取物浓度，因此仅依靠加大草珊瑚提取物处理的剂量可能不足以实现对可可球二孢蒂腐菌的有效抑制，后续仍需寻找更加高效、安全的天然抑菌活性物质，或采用其他植物提取物与草珊瑚提取物复配以达到低剂量、高效的防治。