欧李山楂沙棘复合饮料的研制及其抗疲劳研究

王 瑶，徐春晖，杜俊民

（山西中医药大学中药与食品工程学院，山西 晋中 030619）

身体疲劳是指身体因过度运动而无法维持一定的生理水平或规定的运动强度的状态[1]。目前有关身体疲劳原因的解释、能量衰竭和自由基积累相关问题备受关注。近几十年来，健康学者和运动生理学家越来越关注寻求天然的抗疲劳疗法。目前，功能性饮料已经成了现代研究的热点，一些传统中草药（如刺五加）不仅能提高人类的运动能力，加速消除疲劳，而且副作用很小[2-3]。

欧李（Cerasushumilis（Bge）Sok.）为灌木类野生果树，属蔷薇科樱桃属[4]，为我国所特有的第三代小型水果，具有药食两用特性，因其富含有机酸[5]、多酚类[6]、氨基酸[6]、多肽[6]等成分，具有抗氧化、抗疲劳、抗焦虑和降血压等功效，被广泛用于保健食品[7]。

山楂（CrataeguspinnatifidaBge.）为蔷薇科落叶灌木或小乔木植物果实[8]。其主要有效成分有黄酮类、有机酸类、三萜类化合物等[9]，所含糖分易被人体吸收，与有机酸相配合具有抗疲劳作用。

沙棘（HippophaerhamnoidesL.）属于胡颓子科沙棘属的一类多年生落叶灌木或小乔木[10]，是一种具有极高利用价值的药食同源植物[11]。沙棘果中含有多种生物活性成分，具有良好的抗氧化、降血糖和免疫调节等功能[12]，在保健食品、医疗等领域具有重要的开发价值。

已有报道表明，欧李具有一定的抗疲劳作用，在欧李中加入富含抗氧化成分的山楂和沙棘，一方面可以通过两种特色果汁的自身物性改善欧李饮料的感官品质，另一方面还可能增强欧李中原有的活性成分如花青素、γ-氨基丁酸、钙等的活性，协同饮料的抗氧化作用，达到良好的抗疲劳效果[13]。本试验以欧李、山楂和沙棘为主要原料，研制一种复合饮料，并研究其对小鼠的抗疲劳作用。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

SPF级健康雄性小鼠（3周龄，19～21 g）50只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

欧李，山西农业大学钙果研究组提供；山楂、沙棘，山西吕梁市售；蔗糖，市售；VC，购于河南圣斯德实业有限公司；果胶酶（10 000 U/mL），购于夏盛酶生物有限公司；黄原胶，购于河南万邦实业有限公司；糖原测定试剂盒、乳酸（BLA）测试盒、血尿素氮（BUN）测试盒、还原型谷胱甘肽（GSH）测试盒、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒和丙二醛（MDA）测试盒，购于南京建成生物工程研究所；试验用水为蒸馏水；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 仪器与设备JYL-Y912破壁机，九阳股份有限公司；RE52CS-1旋转蒸发器、B-260恒温水浴锅，上海亚荣生化仪器厂；TFC-203PCA型智能土肥养份综合测试仪，北京强盛分析仪器制造中心；101型电热鼓风干燥箱，北京市永光明医疗仪器有限公司；T2600紫外可见分光光度计，上海祐科仪器表有限公司；BIOBASE-EL10系列自动酶标仪，济南济威医疗器械有限公司；800-1离心机，惠智仪诚（北京）科技发展有限公司；XK96-A快速混匀器，江苏新康医疗器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 欧李汁的制备

称取新鲜欧李果1 kg，清洗、去核、破碎、过滤，加入20 mg/L 0.5%果胶酶，24 h常温静置澄清，再加入0.5 g/LVC增加稳定性。

1.2.2.2 山楂汁的制备

称取新鲜山楂100 g，洗清、去核、切碎，将果肉放入500 mL烧杯中，按液料比3∶1（mL/g）加水浸取山楂汁，在85℃恒温水浴锅中加热30 min，取出烧杯并用保鲜膜密封，静置24 h后，过滤，将过滤液在65℃下用旋转蒸发器浓缩至原来体积的1/2。

需注意不宜把山楂充分破碎，因为浆状山楂不利于后续的软化和浸取。

1.2.2.3 沙棘汁的制备

称取新鲜沙棘100 g，清洗，破碎，过滤，按0.03～0.06g/kg的比例加入果胶酶，常温静置24h，取上清液。

1.2.2.4 调配

欧李汁、沙棘汁、山楂汁、蔗糖以一定比例混合成原料液后，加入复合稳定剂黄原胶进行调配。

1.2.2.5 均质、灌装与灭菌

成品料液在60℃，25 MPa条件下均质10 min后灌装，90～95℃灭菌15～20 min，冷却得欧李山楂沙棘复合饮料。

1.2.3 复合饮料感官评价

邀请10名饮料评价人员，对不同配方制得的欧李山楂沙棘复合饮料的色泽、香气与滋味、组织状态3方面进行评分，总计40分，具体评分标准见表1。

表1 复合饮料感官品质评分标准Table 1 Sensory evaluation of the compound beverage

1.2.4 复合饮料配方优化

1.2.4.1 单因素试验设计

在山楂汁添加量20%，沙棘汁添加量0.5%，蔗糖添加量12 g/L的条件下，考察欧李汁添加量（20%、30%、40%、50%、60%）对复合饮料感官品质的影响；在欧李汁添加量40%，沙棘汁添加量0.5%，蔗糖添加量12 g/L的条件下，考察山楂汁添加量（5%、10%、15%、20%、25%）对复合饮料感官品质的影响；在欧李汁添加量40%、山楂汁添加量15%、蔗糖添加量12 g/L的条件下，考察沙棘汁添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）对复合饮料感官品质的影响；在欧李汁添加量40%，山楂汁添加量15%，沙棘汁添加量1.5%的条件下，考察蔗糖添加量（12、13、14、15、16 g/L）对复合饮料感官品质的影响。

1.2.4.2 正交试验设计

在单因素试验基础上，以欧李汁添加量（A）、山楂汁添加量（B）、沙棘汁添加量（C）和蔗糖添加量（D）为影响因素，以饮料的感官评分（Y）为考察指标，采用L9(34)正交表进行试验设计，正交试验因素水平见表2。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factorsand levelsof orthogonal test formula

1.2.5 动物试验

1.2.5.1 小鼠分组与剂量设计

50只健康雄性小鼠，自由摄食维持饲料，适应性喂养（饲养环境温度为20～25℃，相对湿度为50%～70%）7 d后，根据体重随机分为4组，即对照组及低、中、高剂量组，每组10只小鼠。低、中、高剂量组小鼠每日灌胃最佳配方制备的欧李山楂沙棘复合饮料量分别为0.10、0.20、0.3 mL/10gBW，对照组按0.2mL/10g BW给予生理盐水，全部动物每天灌胃1次，连续灌胃20 d，灌胃期间可自由喂食与饮水[14-15]。

1.2.5.2 负重游泳试验

末次灌胃30 min后，各组小鼠于鼠尾负重5%体重铅皮，于（27±1.0）℃游泳池内开展负重游泳试验，当小鼠在7 s后不能浮出水面呼吸时，则被认为已力竭[16]。

1.2.5.3 体内生化指标检测

末次灌胃结束后，各组剩余小鼠自由游泳30 min，取出擦净，于眼球取血，离心，取血清，于4℃保存血清，按照相关试剂盒说明书要求，检测各组小鼠血清中BLA与BUN的含量[17]；取血后，将小鼠脱臼处死，取出肝脏，生理盐水洗清，滤纸擦干，用小鼠肝脏和生理盐水按照1∶9（g/mL）比例制成10%的肝脏组织匀浆液，离心，取上清液，备用。按照相关试剂盒使用说明，检测各组小鼠SOD活性、GSH活性、MDA含量及肝糖原（HG）含量[18-20]。

1.2.6 数据处理

使用SPSS 22.0进行数据处理及方差分析，Graphpad Prism6软件绘图。试验数据以±s表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 欧李汁添加量对复合饮料感官品质的影响

由图1可知，欧李汁添加量较低时，饮料口感酸涩，有分层现象，且欧李的香气被掩盖；当欧李汁添加量在40%～60%时，饮料呈红色，无分层现象，有欧李独特的风味。考虑到节约成本，选择欧李汁添加量30%、40%、50%进行后续正交试验。

图1 欧李汁添加量对复合饮料感官品质的影响Fig.1 Effect of Cerasushumilis juice addition on sensory of compound beverage

2.1.2 山楂汁添加量对欧李山楂沙棘复合饮料感官品质的影响

由图2可知，当山楂汁添加量为15%时，感官评分最高，此时饮料口感协调，有欧李独特的风味，当添加量增加时，饮料口感酸涩，欧李的香气被掩盖。因此，选择山楂汁添加量10%、15%、20%进行后续正交试验。

图2 山楂汁添加量对复合饮料感官品质的影响Fig.2 Effect of hawthorn juice addition on sensory evaluation of compound beverages

2.1.3 沙棘汁添加量对复合饮料感官品质的影响

由图3可知，随着沙棘汁添加量的增加，感官评分先升高后降低，添加量为1.5%时达到最高。因此，选择沙棘汁添加量1.0%、1.5%、2.0%进行后续正交试验。

图3 沙棘汁添加量对复合饮料感官品质的影响Fig.3 Effect of Hippophae rhamnoides juice addition on sensory of compound beverage

2.1.4 蔗糖添加量对复合饮料感官品质的影响

由图4可知，随着蔗糖添加量的增加，饮料的感官评分先升高后降低，这是由于蔗糖添加量过少，溶液口感偏酸，并且香气混杂；而添加量过多又造成饮料酸甜失调。因此，选择蔗糖添加量13、14、15 g/L进行后续正交试验。

图4 蔗糖添加量对复合饮料感官品质的影响Fig.4 Effect of sucrose addition on sensory of compound beverage

2.2 欧李山楂沙棘复合饮料配方正交试验优化结果

以饮料的感官评分（Y）为考察指标，进行正交试验分析。由表3可知，各因素对欧李山楂沙棘复合饮料感官评价的影响顺序为：欧李汁添加量（A）＞蔗糖添加量（D）＞沙棘添加量（C）＞山楂汁添加量（B）。由表4方差分析可知，欧李汁添加量对复合饮料配比工艺有显著性影响（P＜0.05），山楂汁、沙棘汁、蔗糖添加量影响不显著，最佳配比为A2B2C1D2，即欧李汁添加量40.0%，山楂汁添加量15.0%，沙棘汁添加量1.0%，蔗糖添加量14 g/L。在最佳配比条件下，经3次平行试验，制得的饮料感官评分为34.3分，高于9组正交试验结果，此时饮料呈亮红色、口感协调、组织状态均匀无分层。

表3 正交试验结果Table3 Results of the orthogonal test

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variancetable

2.3 欧李山楂沙棘复合饮料对小鼠负重游泳时间的影响

表5为各组动物的力竭游泳时间，由表5可知，与空白组相比，中、高剂量组力竭游泳时间均明显延长，存在极显著性差异（P＜0.01）；低剂量组无显著性差异。负重游泳试验是最常用的行为绝望动物模型之一，已被广泛用于评估新型化合物的抗疲劳特性[21]。本研究数据显示，欧李山楂沙棘复合饮料能显著延长小鼠力竭游泳时间，提高其运动耐受性。

表5 复合饮料对小鼠力竭游泳时间的影响Table 5 Effect of compound beverage on exhaustive swimming time in mice

2.4 欧李山楂沙棘复合饮料对小鼠血清中尿素氮、乳酸、肝糖原含量的影响

各组小鼠运动后BLA、BUN、HG含量见表6。由表6可知，与空白组相比，中剂量组尿素氮含量具有显著性差异（P＜0.05），乳酸含量有极显著性差异（P＜0.01）；高剂量组尿素氮含量及乳酸含量与空白组相比均具有极显著性差异（P＜0.01）；不同剂量组动物体内HG含量与空白组相比均升高，其中低剂量组有显著性差异（P＜0.05），中、高剂量组具有极显著性差异（P＜0.01）。因此可知，欧李山楂沙棘复合饮料有助于减少小鼠运动后BLA及BUN的积累，增加小鼠的HG含量，为其在运动过程中补充能量。

表6 复合饮料对小鼠尿素氮、乳酸和肝糖原含量的影响Table 6 Effect of compound beverage on the contents of BUN,BLA and HGin mice

2.5 欧李山楂沙棘复合饮料对小鼠体内抗氧化能力的影响

由表7可知，与空白组相比，中、高剂量组小鼠SOD活性显著升高（P＜0.01）；低、中、高剂量组GSH活性均比空白组显著升高，且均呈极显著性差异（P＜0.01）；低、中、高剂量组MDA含量均比空白组降低，其中低剂量组为显著性差异（P＜0.05），中、高剂量组均为极显著性差异（P＜0.01）。以上试验结果表明，欧李山楂沙棘复合饮料能提高小鼠体内抗氧化能力。

3 讨论

山楂汁之所以浓缩至原体积1/2，是为了增加其浓度和颜色，降低香气，避免掩盖欧李果的特殊香气。单因素试验中，沙棘汁最佳添加量为1.5%，但经过正交优化后，最佳添加量为1.0%，这是因为沙棘汁添加量较高时，复合饮料的口感偏酸，分层现象严重，并且沙棘香气过于浓郁。

糖酵解是短时间内剧烈运动的主要能量来源，血乳酸是碳水化合物在无氧状态下的糖酵解产物[22]。血尿素氮是蛋白质和氨基酸的代谢产物。长期运动后，糖和脂肪分解代谢不足，蛋白质和氨基酸的分解代谢会变强，尿素氮显著增加[23]。此外，糖原是运动时重要的能量来源，增加肝脏中储存的糖原可以增强运动耐力，消耗肝糖原会产生疲劳[24-25]，因此，本试验选择血乳酸、尿素氮、肝糖原为疲劳相关指标。

SOD是一种重要的抗氧化酶,当体内有大量的SOD时，可加速疲劳期后的恢复[26]；当MDA含量过高时，容易抑制ATP的产生并造成疲劳[27]。本试验通过小鼠抗氧化试验证明，小鼠每日灌胃欧李山楂沙棘复合饮料浓度增高时，小鼠体内SOD活性上升，MDA含量降低，其间具有显著的量-效关系。当小鼠每日灌胃复合饮料的剂量为0.3 mL/10 g BW时，其体内SOD活性为（33.45±1.20）U/mg Prot，MDA含量为（1.86±0.13）nmol/mg Prot，此时复合饮料抗氧化抗疲劳作用最佳。

4 结论

在单因素试验的基础上，通过正交优化试验确定了欧李山楂沙棘复合饮料最佳配比为：欧李汁添加量40.0%，山楂汁添加量15.0%，沙棘汁添加量1.0%，蔗糖添加量14 g/L，所得饮料呈亮红色、口感协调、组织状态均匀无分层。

以小鼠为研究对象，连续对小鼠灌胃欧李山楂沙棘复合饮料20 d后进行负重游泳试验，结果表明，欧李山楂沙棘复合饮料可减轻小鼠力竭游泳引起的氧化应激，降低其血乳酸和氨等代谢产物，改善肝糖原的合成和储备，提高小鼠抗疲劳能力。