玉米小斑病抗病鉴定接种培养基的产孢技术

蒙成 黄艳花

摘要：以玉米小斑病病菌野生型菌株为试材，探索不同植物组织培养基、温度、培养时间、高低温诱导、光照等条件对分生孢子产生的影响。采用单因素组配18种植物组织培养基，共18个处理，3次重复;设A、B 2个供试温度处理，温度梯度设9个处理，3次重复;设9个培养时间段，3次重复;设6个高、低温诱导处理，3次重复;设6种不同光照处理，3次重复。结果表明，培养基的成分组合对分生孢子的产生起决定性作用，配方为100.0 g高粱、0.2 g 硫酸镁、0.2 g 磷酸钠、15.0 g玉米叶的7号培养基最佳，产孢量最多，产孢量为16.8×104个/g;配方为100 g玉米粒、0.2 g硫酸镁、0.2 g磷酸钠、15.0 g玉米叶的9号培养基次之，产孢量第2，產孢量为10.8×104个/g。在温度为24 ℃条件下培养的产孢量最多;培养时间在35 d内，培养的时间越长，产孢量越多;高温为35 ℃、低温为4 ℃诱导对玉米小斑病病菌产孢量均有一定的促进作用，但经过高、低温诱导后产生的部分分生孢子一端连接1节分生孢子梗;光暗交替各 12 h、光照度为2 000 lx，分生孢子产孢量最高。研究认为，能促进玉米小斑病病菌分生孢子产量增加的最佳组织培养基配方为100 g高粱、0.2 g硫酸镁、0.2 g磷酸钠、15.0 g玉米叶;该培养基在24 ℃、光暗交替各12 h、光照度为 2 000 lx 的条件下，分生孢子产量最高;培养时间在35 d内时，培养的时间越长，产孢量越高;在高温为35 ℃、低温为 4 ℃ 下诱导，对玉米小斑病病菌产孢量均有一定的促进作用，但诱导后产生的部分分生孢子形态发生改变。

关键词：玉米;小斑病菌;培养基;产孢技术;分生孢子

中图分类号： S435.131.4+9  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）11-0144-04

玉米小斑病（southern corn leaf blight，简称SCLB）是世界玉米主产区的重要病害[1]，是我国温暖潮湿玉米产区的重要叶部病害[2]，在玉米全生育期均可发生，发生高峰期为植株抽雄后，感病品种在一般发病年份可减产10%以上，严重发生年份可减产20%～30%[3]。利用抗病种质资源，选育和种植抗病品种是控制玉米小斑病流行的有效措施[4]，在抗病品种的选育与利用过程中，抗病性鉴定已成为玉米育种及其区域适应性的一个常规工作，而获得大量分生孢子，或者获得带大量分生孢子的菌粒是玉米小斑病抗病性接种鉴定工作顺利进行的基础条件。因此，研究并获得大量分生孢子，对玉米小斑病抗病性接种鉴定具有十分重要的意义。玉米小斑病分生孢子通常采用高粱粒组织培养基来培养[5]，产孢效果不甚理想，且在培养过程中容易受到杂菌污染，滋生小昆虫。杨秀娟等发明了CN201510411758.9《一种玉米小斑病菌产孢培养基及其制备方法和应用》，用该方法培养的病菌产孢量约为等量马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基产孢量的1.2～3.6倍，但是该方法还是利用平板培养基进行产孢，其产孢、取孢操作过程繁琐，不便于大面积抗病鉴定操作，不能用带病菌培养基进行接种。国内至今从系统分析角度对玉米小斑病病菌产孢技术进行研究的报道尚不多[6-10]。在玉米小斑病抗病鉴定试验中，通常采用随机分离得到的玉米小斑菌病菌作为供试菌株，有时采用的菌株致病力不强，对抗病鉴定效果不理想;在病菌分离过程中，常采用稀释法进行单孢分离，不能确定是否得到了单细胞纯培养;在病菌保存中，常采用PDA培养基进行培养后保存，但因PDA培养基营养较高，病菌生长旺盛，保存后菌株的活力容易衰退。为了获得产孢效果好、成本低且操作简单、便于进行大面积抗病鉴定的操作方法，本研究采用标记法进行单孢分离获得菌株，以低营养培养基作为菌株保存基质，从而获得大量分生孢子，并经致病力鉴定筛选菌株，确保菌株纯度、致病力及活力，为大面积开展玉米小斑病抗病性鉴定提供保障。本研究以常用接种基物高粱粒、小麦粒及玉米粒为主要材料，以玉米叶、甘露醇、碳酸钾、硫酸镁、磷酸钠等为配料，组配18种植物组织培养基进行产孢培养试验，并对各种产孢培养条件进行初步探索，以寻找1种适合玉米小斑病抗病鉴定用高产分生孢子的培养基及其培养方法，为玉米小斑病抗病性接种鉴定工作简单、高效、准确地开展提供保障。

1 材料与方法

本试验于2017年在广西农业职业技术学院植物保护实验室完成。

1.1 供试菌株

玉米小斑病病菌野生型菌株由广西农业职业技术学院作物研究所玉米试验田的感病病株上采集分离获得，病原菌分离与培养采取常规分离方法，采用病菌孢子稀释纯化法，将病菌产生的分生孢子配制成悬浮液，涂抹于PDA平板培养基上，产生病菌单孢菌落，最终获取纯化菌株，获得病菌的纯培养物[11]。

1.2 供试培养基

供试的培养基分别以高粱粒、小麦粒及玉米粒为主要材料，以玉米叶、甘露醇、碳酸钾、硫酸镁、磷酸钠等为配料，单因素组配18种培养基。高粱粒处理方法如下：挑选籽粒饱满、大小一致、无病虫的带皮高粱水煮25 min，经水洗沥干备用;小麦粒处理方法如下：挑选籽粒饱满、大小一致、无病虫的带皮小麦粒浸泡20 min后，水煮15 min后水洗沥干备用;玉米粒的处理方法如下：挑选大小一致、无病虫的玉米粒浸泡 12～15 h，水煮1 h，水洗沥干备用;玉米叶用刚从大田采集的新鲜玉米叶，切成约1 cm2左右的碎片备用;培养基制作方法如下：按配方配制，把所需成分混匀，湿度以药品能溶解，玉米叶能掺和在籽粒上而无滴水为宜。将配好的培养基装入 250 mL 三角瓶中，每瓶装100 g配好的培养基，于121 Pa高压灭菌45 min备用。

1.3 供试仪器

试验用培养箱为LRH-250-GSB1珠江牌培养箱。

1.4 不同培养条件对分生孢子产量的影响

1.4.1 培养基对分生孢子产量的影响 单因素组配18种植物组织培养基进行产孢量试验，每个配方1个处理，每个处理3次重复，共18个处理，具体配方见表1。玉米小斑病病菌菌种在PDA培养基上扩繁6 d，菌丝长满9 cm培养皿后，用带PDA培养基的菌丝接种到供试植物组织培养基上，每份处理接种半皿菌种（下同）。接种后的培养瓶于24 ℃、全黑暗条件的培养箱中培养11 d，测定产孢量。

1.4.2 温度对分生孢子产量的影响 以7号培养基为供试培养基，分别在12、16、20、24、26、28、32、36、40 ℃共9个温度梯度下黑暗培养11 d[12]，3次重复。设A、B 2个处理：A处理为接种后的培养基瓶分别直接于各温度培养11 d后测定产孢量;B处理为接种后的培养基瓶于26 ℃全黑暗条件下培养5 d，菌丝长满培养基后转入各温度下继续培养6 d后测定产孢量。

1.4.3 培养时间对分生孢子产量的影响 7号培养基为供试培养基，将接种后的培养瓶分别放入温度为20、24 ℃的黑暗条件培养箱中培养，分别于培养5、7、9、11、15、20、25、30、35 d时测定产孢量，重复3次。

1.4.4 高、低温诱导对分生孢子产量的影响 7号培养基为供试培养基，把接种后的培养基瓶放入温度为26 ℃的全黑暗条件下培养5 d，菌丝长满培养基后转入各高、低温条件下进行诱导处理，处理结束后放入温度为24 ℃的黑暗条件下继续培养6 d后测定产孢量。设7个处理：温度为4 ℃，分别处理12、24、48 h;温度为35 ℃，分别处理12、24、48 h与对照（26 ℃ 全黑暗下培养5 d后直接转入24 ℃黑暗培养 6 d）[13]，重复3次。

1.4.5 光照对分生孢子产量的影响 7号培养基为供试培养基，分别使用24 h黑暗、12 h黑暗+12 h光照（1 500、2 000、3 000 lx共3种不同光照度梯度）、24 h光照（光照度为 3 000 lx），在这3种不同光照方式处理下于24 ℃恒温培养 11 d[14]。

1.5 分生孢子产量的测定

取各处理2 g含病菌的培养基放入50 mL烧杯中，加 10 mL 水，用不绣钢勺子连续搅拌约100次，以保证能将菌株所产生的分生孢子刮下至孢子脱落至水里，过滤得到孢子悬浮液，用血球计数板计算1 mL孢子悬液中所含孢子数，折算成1 g培养基产生的孢子量。每个处理取样3次，每样品读数3次。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对病菌分生孢子产量的影响

由图1可知，不同培养基对玉米小斑病病菌产孢子量有明显影响，14个配方的培养基产孢量超过对照（常用的高粱培养基），配方7号培养基产孢子数量最多，为16.8×104个/g;配方9号培养基产孢子量次之，为10.8×104个/g;排在第3、4位的为13、11号培养基，产孢量分别为8.0×104、7.7×104个/g;14、2、6号培养基产孢量相当，分别为5.7×104、5.5×104、5.2×104个/g; 3、4、8、15、18、12、10号培养基的产孢量依次为3.2×104、2.7×104、2.1×104、1.3×104、

1.2×104、1.2×104、1.1×104个/g;常用的高粱培养基（CK）产孢量为6.8×103个/g，17、16、5号培养基产孢量少于对照，分别为6.5×103、2.2×103、5.4×102个/g。因此可见，7号培养基为玉米小斑病病菌分生孢子产生的最佳培养基。

2.2 温度对病菌分生孢子产量的影响

由图2可知，培养温度对玉米小斑病病菌分生孢子产量的影响较大，温度过低或过高都不利于分生孢子的产生，处理A在温度≤12 ℃或≥32 ℃时，均不产生分生孢子，在温度为 16～28 ℃时，能够产生孢子，在温度为20～26 ℃时，产孢量最多，其中在温度为24 ℃的条件下产孢量最多;处理B在温度为12～40 ℃的条件下均可以产生分生孢子，26 ℃时产孢量最高，24 ℃时次之。因此，将接种后的培养基在24 ℃条件下进行培养是玉米小斑病病菌分生孢子产生的最适宜温度。

2.3 不同培养时间对病菌分生孢子产量的影响

由图3可知，培养时间对玉米小斑病病菌产孢量影响较大，在温度为20、24 ℃的条件下培养，培养时间在35 d内时，培养时间越长，产孢量越多;培养时间在30 d内时，24 ℃处理的产孢量均高于20 ℃处理。因此，在温度为20、24 ℃的条件下培养，培养时间为35 d是玉米小斑病病菌分生孢子产生量最多的时间。

2.4 高、低温诱导对病菌分生孢子产量的影响

由图4可知，在温度为4 ℃中冷冻24 h的处理产孢量最高，为4.2×105个/g;35 ℃热激24 h的处理效果次之，产孢量为3.5×105个/g;35 ℃热激48 h与4 ℃冷冻12 h的效果相差不大，产孢量分别为3.2×105、3.1×105个/g;4 ℃冷冻 48 h 与35 ℃热激12 h处理与对照差别均不明显。研究发现，高、低温诱导对玉米小斑病病菌产孢量均有一定的促进作用，但是经过高、低温诱导后产生的部分分生孢子一端连接1节分生孢子梗，对分生孢子的活性是否产生影响有待进一步研究。

2.5 不同光照条件对病菌分生孢子产量的影响

由图5可知，光照条件对玉米小斑病病菌产孢量有一定的影响，适量的光照对该病菌产孢量有促进作用。在连续 24 h 黑暗条件下不利于产孢，产孢量为1.9×105个/g;12 h黑暗+12 h光照（2 000 lx光照度）条件下产孢量最多，达到 4.6×105个/g;12 h黑暗+12 h光照（1 500 lx光照度）条件下产孢量次之，为3.3×105个/g;高强度光照即12 h黑暗+12 h光照（3 000 lx光照度）条件对该病菌产孢量有抑制作用，产孢量为2.5×105个/g;连续24 h光照（光照强度為 3 000 lx）条件下最不利于产孢，产孢量为1.4×105个/g。因此，12 h黑暗+12h光照（2 000 lx光照度）条件最有利于玉米小斑病病菌分生孢子的生长，产孢量最多。

3 结论与讨论

在促进植物病原真菌产孢的研究进程中，有研究表明，培养基与孢子产生的关系最大， 采用不同的培养基或者改变它们 的成分， 是促进孢子产生的最主要途径[11]。研究表明，不

同培养基对多数茄链格孢的产孢量有明显影响[15-16]。因此，前人开展了通过培养基促进产孢量的研究工作，结果表明，绿豆汤培养液是蕉斑镰刀菌液体摇瓶产孢最好的培养液，在适宜条件下，产孢量达到1×106 mL[17];苹果腐烂病病菌在加蜂蜜水和蛋白胨的带壳大麦上能大量产孢[18];辣椒疫霉菌在胡萝卜、黑麦和燕麦培养基中均能产生孢子囊，在胡萝卜培养基上产生孢子囊的数量最多[19]。本研究选用18种不同培养基诱导玉米小斑病病菌分生孢子的产生，研究发现，使用配方为100 g高粱、0.2 g硫酸镁、0.2 g磷酸钠、15.0 g玉米叶的7号培养基和配方为100 g玉米、0.2 g硫酸镁、0.2 g磷酸钠、15.0 g 玉米叶的9号培养基产孢量较多，分别为16.8×104、10.8×104个/g;17、16、5号培养基产孢量最少，分别为6.5×103、2.2×103、5.4×102个/g。

有研究表明，玉米小斑病病菌产孢最适温度为25 ℃[20];玉米小斑病斑产孢的适宜温度为20～30 ℃，最适温度为 26 ℃，在5 ℃以下、35 ℃以上不能产孢[10]。本研究发现，玉米小斑病病菌在温度12 ℃以下或32 ℃以上时，病原菌菌丝体生长缓慢，不能产孢;在温度为16～28 ℃时，病原菌菌丝生长速度快，能够产孢;在温度为20～26 ℃时，病原菌产孢量迅速增加，在温度为 24 ℃ 的条件下，产孢量最多。长菌丝后的培养基转入各温度中均可以产孢，在温度为26 ℃时，产孢量最高，24 ℃次之。说明该病菌的菌丝生长温度条件高于分生孢子产生的条件，菌丝一旦生成，在较高和较低的温度条件下，分生孢子均能产生，这可能是玉米小斑病病菌能在全世界玉米产区发生的原因之一。

本研究发现，培养时间对玉米小斑病病菌产孢量影响较大，在温度为20、24 ℃的条件下培养，在培养时间为35 d内，培养时间越长，产孢量越多。与前人研究结果[21]基本一致。

在高温为35 ℃、低温为4 ℃的条件下诱导，对玉米小斑病病菌产孢量均有一定的促进作用，但经过高、低温诱导后产生的部分分生孢子一端连接1节分生孢子梗，对分生孢子的活性是否产生影响有待进一步研究。

本研究发现，光照条件对玉米小斑病病菌产孢量有一定的影响，适量的光照对该病菌产孢量有促进作用，在12 h光照+12 h黑暗交替且光照度约为2 000 lx的条件下产孢量最多。与前人研究的光照能显著抑制病菌产孢的结果[1]有一定出入，须进一步通过试验验证。

利用单因素组配确定促进玉米小斑病病菌分生孢子产量增加的最佳组织培养基配方为100 g高粱、0.2 g硫酸镁、0.2 g 磷酸钠、15 g玉米叶的7号培养基;该培养基在温度为24 ℃、光暗交替各12 h、光照度为2 000 lx的条件下，分生孢子产量最高;培养时间在35 d内，培养的时间越长，产孢量越高。高温为35 ℃、低温为4 ℃诱导对玉米小斑病病菌产孢量均有一定的促进作用，但诱导后产生的部分分生孢子形态发生改变。

参考文献：

[1]陈利峰. 农业植物病理学[M]. 北京：中国农业出版社，2002.

[2]赵聚莹，屈振刚，贾海民，等. 不同玉米品种对小斑病强致病力菌的抗病性检测[J]. 河北农业科学，2010，14（9）：66-67.

[3]龚现丽. 夏玉米小斑病的发生与防治[J]. 河南农业，2010（17）：19.

[4]张传模. 玉米种质资源对小斑病的抗病性鉴定研究[J]. 植物保护，1991（16）：18-19.

[5]王晓鸣，石 洁，晋齐鸣，等. 玉米病虫害田间手册：病虫害鉴别与抗性鉴定[M]. 北京：中国农业科技出版社，2002.

[6]陈 颖，郝丽梅，王立安. 不同培养基对玉米小斑病菌生长繁殖及致病力的影响[J]. 河北师范大学学报（自然科学版），2003，27（2）：192-194.

[7]刘克明，吴全安，刘俊芳，等. 玉米小斑病菌三个生理小种生物学特性比较的初步研究[J]. 华北农学报，1989，4（2）：74-78.

[8]谢红辉. 玉米小斑病菌生物学特性研究[J]. 广西热带农业，2010（6）：1-4.

[9]陆宁海，吴利民，郎剑锋，等. 玉米小斑病菌对碳氮源的利用[J]. 江苏农业科学，2015，43（5）：111-112.

[10]王晓梅，吕平香，李莉莉，等. 玉米小斑病重要流行环节的初步定量研究[J]. 吉林农业大学学报，2007，29（2）：128-132.

[11]方中达. 植病研究法[M]. 3版.北京：中国农业出版社，1998：1-427.

[12]刘 静，李国华，周 明，等. 橡胶树白粉菌分生孢子萌发条件及存活时间的研究[J]. 西南农业学报，2014，27（1）：151-155.

[13]张立杰，张慧玲，哈矿武，等. 甜瓜蔓枯病病原菌分离与分生孢子的产孢诱导[J]. 宁夏大学学报（自然科学版），2015，36（4）：382-385.

[14]冯胜泽，刘星晨，王海祥，等. 玉米大斑病菌分生孢子形成的影响因素及GATA转录因子家族的表达分析[J]. 中国农业科学，2017，50（7）：1234-1241.

[15]刘丽丽，朱杰华，崔亚婧，等. 培养条件对茄链格孢产孢的影响[J]. 菌物学报，2014，33（3）：659-667.

[16]秦艳梅，张爱民. 微生态发酵床功能菌株产孢条件的优化[J]. 江苏农业科学，2017，45（4）：235-238.

[17]庄义庆，乔广行，王源超，等. 蕉斑镰刀菌326菌株产孢条件研究[J]. 南京农业大学学报，2008，31（4）：77-81.

[18]赵 红，王彩霞，陈晓忍，等. 苹果腐烂病菌诱导产孢方法[J]. 中国农学通报，2012，28（10）：151-154.

[19]兰成忠，刘裴清，李本金，等. 辣椒疫霉菌产孢培养基及诱导方法筛选[J]. 热带作物学报，2013，34（9）：1776-1780.

[20]代玉立，甘 林，阮宏椿，等. 福建省玉米小斑病菌的生物学特性研究[J]. 中国农学通报，2016，32（31）：131-137.

[21]吳安国，张培高，王桂英. 玉米大斑病带菌高梁粒接种抗性鉴定技术[J]. 云南农业科技，1994（6）：12.甄丹妹，郭景红，韩 兴，等. 玫瑰黄链霉菌活性代谢产物诱导黄瓜白粉病抗性[J].