丹皮酚对胰腺癌PANC-1细胞凋亡及GRP78/TRAF2信号通路的影响

沈惠琳 李为民# 胡成琛 钱 瑾 吴建良 李国栋

1 杭州师范大学附属医院 浙江 杭州 310015

2 杭州市丁桥医院 浙江 杭州 310016

丹皮酚是一种从牡丹皮中分离出来的天然酚类化合物，具有多种临床药理功效，包括抗炎、镇静、抗肿瘤等作用[1，2]。近年来研究发现，丹皮酚可在乳腺癌、胃癌和大肠癌中发挥抗癌作用[1,3，4]。丹皮酚还可加强表阿霉素的化疗疗效，减轻心脏毒性[5]。但罕有丹皮酚作用胰腺癌及其分子机制的研究。内质网应激（ERS）作为机体应对外界刺激的应激反应，同时参与肿瘤发生发展，其中葡萄糖调节蛋白78（GRP78）起到调控细胞增殖及代谢能力的作用[6]。GRP78可通过肌醇酶-1（IRE1）/肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)信号通路促使凋亡蛋白Caspase-12表达增加，诱导细胞凋亡发生[7]。本研究旨在探讨丹皮酚对胰腺癌细胞的抗癌作用，观察丹皮酚对内质网应激GRP78/TRAF2信号通路影响，研究其抗癌作用机制。

1 材料与仪器

1.1 细胞株与主要试剂：人胰腺癌细胞PANC-1细胞株购自中国科学院细胞库上海细胞生物学研究所；丹皮酚(批号19051503，纯度＞98%)，购自上海普锐生物科技有限公司；二甲亚砜（DMSO，批号MFCD00002089）和内质网应激抑制剂四苯基乙酸（4-PBA，批号MFCD00800247）均购自美国Sigma公司；胎牛血清（批号SA311.02）购自兰州民海生物工程有限公司；高糖DMEM培养基（批号11995065）购自美国Gibco公司；青霉素-链霉素溶液（批号C0222）、BCA试剂盒（批号P0010）和增强型CCK-8试剂盒（批号C0042）购自上海碧云天生物技术有限公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒(批号70-APCC101-100)购自杭州联科生物技术股份有限公司；GRP78抗体（批号ER40402）、TRAF2抗体（批号ET1612-5）、Bax抗体（批号EM1203）、内参 GAPDH（批号EM1101）和HRP 标记的IgG抗体（批号HA1001）均购自浙江杭州华安生物有限公司；Cleaved Caspase-12抗体（批号 35965）和Cleaved Caspase-3抗体（批号9664）均购自美国CST公司。

1.2 主要仪器：ACB-4A1超净工作台(新加坡ESCO公司)；3111恒温CO2培养箱(美国Thermo公司)；X-30R低温高速离心机(美国贝克曼库尔特公司)；TS100倒置显微镜和光学显微镜(日本Nikon公司)；80i荧光显微镜系统(日本Nikon公司)；1575全自动酶标仪洗板机（美国BIO-RAD公司）；PCR扩增仪(美国ABI公司)；流式细胞仪(美国Beckman公司)。

2 方法

2.1 细胞培养：用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基培养细胞，置于37℃、5% CO2恒温培养箱培养。根据细胞生长情况，每2～3天更换一次新鲜培养基，待细胞进入对数生长期，按1∶3比例进行传代，部分细胞用于后续实验。将丹皮酚溶于DMSO中，配制成终浓度为12、25、50、100、200μg/ml的溶液，不同浓度丹皮酚处理PANC-1细胞，培养0～72h用于后续实验。

2.2 丹皮酚对细胞增殖的影响：取对数生长期的PANC-1细胞，用0.25%胰酶消化并收集细胞，按4×104个/ml接种于96孔培养板中(每孔100μl)，培养过夜后予不同浓度丹皮酚(12.5～200μg/ml)干预24h、48h、72h，应用CCK-8法检测细胞增殖能力。每孔加入含有10μl CCK-8的培养基100μl，继续孵育2h，经振荡混匀后采用酶标仪(波长450nm)检测细胞存活率情况。

2.3 丹皮酚对细胞集落形成的影响：PANC-1细胞株分为3组，即空白对照组、100μg/ml丹皮酚组和200μg/ml丹皮酚组。通过不同浓度丹皮酚干预PANC-1细胞后，恒温培养箱培育8～10天（每2～3天更换新鲜培养液）。采用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，PBS冲洗残余染液、晾干，相机拍摄记录各组细胞形成集落数量。

2.4 丹皮酚对细胞迁移能力的影响：取对数生长的PANC-1细胞株，经消化、离心、重悬后，调整细胞浓度(l×l06个/ml，2ml/孔)接种至6孔板中，培养24h，用高压灭菌后200μl黄枪头均匀地从一端到另一端进行划痕并通过倒置显微镜(100×)拍照记录划痕的宽度，随后给予不同浓度（100、200μg/ml）的丹皮酚干预24、48、72h后观察划痕愈合情况，以评估细胞迁移能力。

2.5 丹皮酚对细胞凋亡的影响：取PANC-1细胞株分别经不同浓度丹皮酚（100、200μg/ml）干预48h后，收集细胞，分别（0.5～1.0）×105个细胞用70%乙醇在4℃中固定过夜，后加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI,混匀，使用流式细胞仪上机测定，FlowJo软件分析凋亡情况。结果将根据Annexin V-FITC和PI划分为4个象限，其中早期凋亡细胞(Annexin V-FITC阳性/PI阴性)和晚期凋亡/部分坏死细胞(Annexin V-FITC阳性/PI阳性)，计算（早期凋亡细胞+晚期凋亡）/部分坏死细胞百分比为总细胞凋亡率。

2.6 丹皮酚对细胞凋亡相关蛋白影响：丹皮酚作用PANC-1细胞株对细胞凋亡相关蛋白（Bax和Cleaved Caspase-3）的影响，通过Western blot法检测蛋白表达量变化情况：①总蛋白提取：取100、200μg/ml丹皮酚干预PANC-1细胞48h，PBS清洗2遍，加入100μl RIPA裂解液，冰上裂解，低温高速离心，取上清待用；②蛋白浓度测定：采用BCA法测定蛋白的总浓度；③SDS-PAGE电泳：蛋白样本按每孔35μg变性后进行SDS-PAGE电泳，转至NC膜上，封闭lh，加入一抗4℃震荡过夜，TBS-T洗膜，加入二抗室温孵育lh，TBS-T清洗后加入ECL发光液，用Bio-Rad凝胶成像系统扫描并进行数据分析。

2.7 抑制内质网应激对丹皮酚促细胞凋亡的影响：实验组加入内质网应激抑制剂4-PBA预处理细胞来抑制内质网应激反应。实验分为4组：空白对照组、单用丹皮酚（200μg/ml）组、单用4-PBA(300μmol/L)组和4-PBA联合丹皮酚组。各组药物作用48h后利用Western blot检测细胞内质网应激相关蛋白(GRP78、TRAF2)和凋亡相关蛋白（Cleaved Caspase-12）表达。

2.8 统计学分析：采用Prism5.0软件和SPSS 26.0统计软件。计量资料两组间以t检验评价，多组间应用单因素方差分析(ANOVA)评价。数据图采用GraphPad Prism 7绘制。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 丹皮酚对细胞增殖和克隆能力的影响：为了研究丹皮酚对人胰腺癌细胞株PANC-1的影响，进行了CCK-8测定(图1B)。丹皮酚以剂量和时间依赖的方式抑制PANC-1细胞的增殖能力，分别在干预48h和72h时细胞存活率为 73.3%（100μg/ml）、68.5%（200μg/ml）和72.9%（100μg/ml）、60.3%（200μg/ml）(P＜0.05)。通过SPSS数据计算48h时间段200μg/ml丹皮酚的细胞抑制浓度(IC50)值为278μg/ml。克隆形成实验中可知，100μg/ml和200μg/ml丹皮酚干预PANC-1细胞可明显抑制细胞克隆形成（见图1C）。因此，丹皮酚可抑制PANC-1细胞增殖及克隆能力。

图1 丹皮酚化学结构式（A）及其对PANC-1细胞存活率（B）和克隆形成能力（C）的影响(±s,n=3)

3.2 丹皮酚对细胞迁移作用的影响：划痕实验数据显示，100μg/ml和200μg/ml丹皮酚均可抑制PANC-1迁移，其中丹皮酚作用72h后细胞划痕愈合能力明显下降(图2)。

图2 丹皮酚对PANC-1细胞的迁移能力的影响(±s,n=3)

3.3 丹皮酚对细胞凋亡的影响：用流式细胞术检测不同浓度丹皮酚作用细胞48h后细胞凋亡水平。由图3可知，对照组细胞凋亡率（早期凋亡+晚期凋亡）为3.37%，100μg/ml丹皮酚组凋亡率为7.50%，200μg/ml丹皮酚组凋亡率为20.27%(图3A-B)。

图3 丹皮酚对PANC-1细胞凋亡能力的影响(±s,n=3)

3.4 丹皮酚对细胞凋亡和GRP78/TRAF2蛋白的影响：为了阐明丹皮酚对胰腺癌细胞凋亡的影响，我们采用Western blot检测凋亡相关蛋白（Bax和Cleaved Caspase-3）。从图4可知，100μg/ml和200μg/ml丹皮酚促使Bax和Cleaved Caspase-3的表达上调。进一步研究内质网应激在丹皮酚促细胞凋亡中作用，与空白对照组比较，单用丹皮酚组可显著上调内质网应激相关蛋白GRP78、TRAF2和凋亡蛋白Cleaved Caspase-12的表达(图5)。与单用丹皮酚组比较，4-PBA联合丹皮酚组可抑制单用丹皮酚上调GRP78、TRAF2和Cleaved Caspase-12作用。

图4 丹皮酚对PANC-1细胞凋亡相关蛋白的影响(±s,n=3)

4 讨论

本实验发现丹皮酚作用于胰腺癌细胞PANC-1可促使细胞发生凋亡。死亡受体信号通路、线粒体通路和ERS信号通路是细胞凋亡的三大重要途径。越来越多研究发现ERS与癌细胞的凋亡和自噬密切相关[8]。中药治疗胰腺癌，早期以清热解毒、疏肝利胆为主，晚期以扶正固本为主[9]。许多中草药如姜黄素、温郁金和艾叶均可诱导ERS[10-12]。利用中草药诱导肺癌细胞发生ERS，通过上调IRE1、TRAF2和Caspase-12蛋白的表达，下调Bcl-2的表达，最终诱导细胞凋亡[13]。因此，我们通过本实验从ERS的角度进一步研究丹皮酚调控胰腺癌细胞凋亡的机制。

ERS可通过多种方式诱导细胞凋亡，其中包括激活ERS相关的促凋亡分子，如Caspase-12和GADD34[14]。在正常的生理状态下，GRP78通常与IRE1紧密结合。IRE1通过招募TRAF2激活凋亡信号调节激酶1(ASK1)。ASK1细胞因子作为各种细胞凋亡的关键作用因素，在内质网应激状态下，可促进c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化，进而激活JNK信号级联反应，最终诱导细胞凋亡。TRAF2是凋亡信号从内质网传递到细胞质的重要蛋白。敲除TRAF2的上游蛋白E3泛素连接酶（CHIP）后，IRE1不能作为复合物与TRAF2结合，无法激活ASK1-JNK信号通路和诱导细胞凋亡[15]。内质网中存在多种细胞凋亡因子，其中Caspase-12是ERS过程诱导细胞凋亡所必需蛋白。当内质网中外界因素干扰下出现钙离子的动态平衡被破坏，Caspase-12可被直接激活，激活状态Caspase-12（即Cleaved Caspase-12）可裂解Caspase-3并诱导细胞凋亡。因此，GRP78/TRAF2/Caspase-12信号通路是ERS致细胞凋亡的重要分子机制之一。

本研究发现，丹皮酚处理人胰腺癌细胞PANC-1后，ERS相关蛋白GRP78、TRAF2和凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-12、Cleaved Caspase-3、Bax表达上调，进一步证实丹皮酚可诱导ERS和细胞凋亡。通过4-PBA抑制ERS，丹皮酚上调GRP78、TRAF2作用减弱，且促凋亡蛋白Cleaved Caspase-12作用也受抑制。因此，我们认为丹皮酚诱导细胞凋亡可能与其上游的内质网应激GRP78/TRAF2信号通路变化有关。