正常血镁Gitelman综合征1例的临床表现及基因诊断分析

周建华，李晓华，张宏利

上海中医药大学附属第七人民医院内分泌代谢科，上海 200137

Gitelman 综合征是由编码噻嗪类敏感的Na+/Cl－共转运蛋白（thiazine-sensitive NaCl cotransporter，NCCT）的SLC12A3基因突变引起的常染色体隐性遗传的肾小管疾病，以低血钾、低血镁、低尿钙和继发性醛固酮增多症为主要特征。据报道，其发病率为1/40 000～10/40 000，在亚洲更为多见［1］。因其起病隐匿，在临床中易被忽视或误诊。本研究报道1 例正常血镁Gitelman综合征并做文献复习，旨在提高临床医师对该病的认识和诊治水平。

1 病例资料

1.1 一般病史

患者男性，33 岁，因“发热伴四肢麻木1 d”就诊于上海中医药大学附属第七人民医院急诊，当时查血钾2.78 mmol/L，给予补钾治疗后手足麻木缓解。后因“反复右手第二指指间关节疼痛4 年”就诊于上海中医药大学附属第七人民医院内分泌科，再次发现血钾偏低，血钾2.94 mmol/L。追问病史，患者无乏力、手足麻木、手足抽搐、双下肢软瘫、多尿、嗜盐等症状，仅于发热时自觉手足麻木，发热缓解后手足麻木可自行缓解，无慢性腹泻及呕吐史，无噻嗪类利尿剂及泻药服用史。父亲母亲均体健。发病以来，饮食睡眠可，大小便正常，体质量无变化。

体格检查：体温36.8 ℃，脉搏80 次/min，呼吸18次/min，血压100/70 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），体质量71.1 kg，身高165 cm，体质量指数（body mass index，BMI）26.1 kg/m2。正常体型。心肺腹（-），脊柱四肢无畸形，双下肢无水肿。四肢肌力肌张力正常，四肢活动自如。生理反射存在，病理反射未引出。右手第二指指间关节红肿热痛。

实 验 室 检 查： 血 钾2.94 mmol/L， 血 钠139 mmol/L， 血 氯100 mmol/L， 总 二 氧 化 碳31.5 mmol/L，血钙2.43 mmol/L，血磷1.41 mmol/L，血镁0.76 mmol/L。24 h 尿中，尿钾39.1 mmol，尿钠329.0 mmol，尿钙0.6 mmol（正常值2.5～7.5 mmol），尿肌酐12.4 mmol，尿酸2 128.0 μmol，尿微量白蛋白7.7 mmol，尿蛋白84.70 mg，尿pH 5.5。立位肾素31.64 pg/mL，立位血浆醛固酮197.98 pg/mL。血尿素氮4.69 mmol/L， 血 肌 酐64.1 μmol/L， 血 尿 酸586.2 μmol/L。葡萄糖耐量试验示空腹葡萄糖4.80 mmol/L，2 h 血糖4.65 mmol/L，糖化白蛋白11.2%，糖化血红蛋白5.0%。血促肾上腺皮质激素56.84 pg/mL，血皮质醇18.43 μg/dL。甲状腺功能及抗体正常。自身免疫抗体13项正常。

泌尿系彩超、双肾上腺增强CT 均未见异常。右手双能CT见第二指指间关节旁痛风石（图1）。

1.2 基因诊断

使用Illumina hiseq2500 二代DNA 测序方法对SLC12A3、CLCNKB基因进行了测序分析，发现先证者在SLC12A3基因8号外显子和15号外显子分别存在1个杂合突变位点，并分别来源于母亲和父亲［exon8：c.1084G>A（图2）。exon15：c.1850A>G（图3）］。对其进行一代Sanger法验证，SLC12A3基因上游引物5'-TCAGTGGGCTGGATG-CAGAGACG-3'，下 游 引 物5'-GGGAAGAACAGGAT-TCAGGCAAGCTGG-3'，产物1 455 bp。结果确认此2个位点突变。此2个突变使相邻的2 个氨基酸密码子发生错义突变：p.G362S，p.Q617R。2种变体均位于NCCT蛋白的细胞内结构域，其中一种变体位于羧基末端区域（图4）。在dbSNP135及1000 genomes project数据库中，突变p.G362S 未见记录，突变p.Q617R 频率极低。而在gnomAD 正常人数据库（ACMG-PM2）里，本研究发现的2个变异均未见记录，迄今为止也没有文献报道。根据ACMG基因变异致病性评估指南，这2个变异被分类为临床意义未明变异。

图2 SLA12A3基因外显子8检测到的致病突变c.1084G>AFig 2 Pathogenic mutation c.1084G>A detected in exon 8 of SLA12A3 gene

图3 SLA12A3基因外显子15检测到的致病突变c.1850A>GFig 3 Pathogenic mutation c.1850A>G detected in exon 15 of SLA12A3 gene

图4 预测NCCT突变的拓扑定位Fig 4 Predicted topological localization of NCCT mutations

1.3 计算机辅助鉴别有害的变异体

SIFT 和PROVEAN 软件是2款用于评估研究中发现的外显子区变异是否有损于蛋白质功能的常用工具程序。SIFT 软件输出的分值区间为0～1，当变异体得分≤0.05 时判定为有害的（damaging），>0.05 时则判定为可接受的（tolerated）。PROVEAN 软件对位点保守性的评分若≤-2.5， 则判定为有害的影响（deleterious）。本研究中发现的错义突变p.G362S，应用SIFT 软件得分为0，应用PROVEAN 软件得分为-5.44，被判定为有害的变异；错义突变p.Q617R，应用SIFT 软件得分为0，应用PROVEAN 软件得分为-3.86，被判定为有害的变异。

1.4 基因突变后蛋白质结构预测

通过将SLC12A3基因运用Swiss model预测其蛋白结果发现，变异后将会使其三维结构发生改变（图5）。

图5 蛋白质结构预测图Fig 5 Predicted structure of the protein

1.5 诊治及随访

诊断：①Gitelman综合征。②痛风性关节炎急性发作期。治疗：①补钾治疗。予口服氯化钾缓释片1.0 g/次，3 次/d。②消炎止痛治疗。予秋水仙碱片0.5 mg/次，3 次/d，疼 痛 缓 解 后 调 整 为0.5 mg/次，1次/d。随访：患者1 d后右手指间关节疼痛缓解，1周后复查血钾3.10 mmol/L，2 周后加用苯溴马隆胶囊50 mg/次，1次/d，1个月后复查血钾3.22 mmol/L，血镁0.80 mmol/L，血尿酸287.0 μmol/L，患者无不适。

2 讨论

Gitelman 综合征又称家族性低钾低镁血症，临床表现有嗜盐、抽搐、肌肉无力、乏力，多尿、关节痛、软骨钙质沉着症、生长迟缓等等，其临床表现主要与低钾血症和低镁血症有关。而SLC12A3的双等位基因失活突变确定是确诊Gitelman 综合征的金标准［2］。也有报道［3］称18%～40%的疑似Gitelman综合征患者仅发现了单等位基因突变，不符合常染色体隐性遗传规律；推测与基因重组后出现大片段的结构异常有关，而目前二代测序的方法对于大片段的缺失或重复缺乏相应的检测敏感性。

本例Gitelman综合征患者血镁水平正常，并且无乏力、嗜盐、抽搐、多尿等相关临床症状，仅于发热时出现四肢麻木，临床相对少见，需要与Bartter综合征相鉴别。本病例低尿钙以及二代测序未发现CLCNKB基因突变的临床特点均支持Gitelman综合征诊断。有报道称，Gitelman综合征的临床表现的严重程度与血镁的水平呈负相关［4-5］。血镁水平降至0.5 mmol/L 以下才导致显著的症状和体征，临床表现包括神经肌肉过度兴奋、震颤、抽搐和昏迷［6］。腕部痉挛或手足抽搐被认为是由于低镁血症引起［7］，血镁正常的Gitelman综合征患者表现为较低频率的腕部痉挛或手足抽搐，以及较轻的电解质紊乱，代谢性碱中毒和肾素-血管紧张素-醛固酮系统（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS） 的 激 活［4］。本病例患者无相关自觉临床症状，考虑与血镁水平正常有关。已有报道［8-11］显示8%～22%的Gitelman 综合征患者血镁正常。目前，Gitelman综合征低镁血症的发病机制仍不明确。镁是细胞内第二丰富的阳离子，在多种生物活性中发挥着重要作用。血镁浓度与肠吸收密切相关，主要由肾排泄调节。虽然远曲小管通过瞬时受体电位蛋白酶抑制素6 亚型（transient receptor potential cation channel subfamily M，member 6，TRPM6）介导只吸收超滤液中5%～10%的镁离子，但它是吸收镁离子的最后一个部位，起到调节尿镁浓度的作用，因此它决定了最终的血镁浓度。TRPM6突变的发现是家族性低镁血症继发性低钙血症的原因，阐明了TRPM6 可渗透性通道缺陷表达的特征［12］。NIJENHUIS 等［13］在一项对NCCT 缺陷小鼠的研究中发现，远曲小管TRPM6 的表达减少可能是造成低镁血症的原因。JIANG 等［4］在一个32 例的Gitelman综合征患者的队列研究中发现，低镁血症组TRPM6 表达较正常对照组明显下调，而正常血镁组TRPM6 表达较正常对照组无显著差异。也有研究表明，性别可能影响Gitelman 综合征患者的血清镁水平。LIN 等［14］报道了2 个病例证实为Gitelman 综合征的家系，其中男性患者血镁正常，而具有相同突变的女性患者血镁过低。也有学者认为，Gitelman综合征患者的血浆游离镁浓度比总镁浓度更有意义。TOSI等［15］发现血浆总镁浓度正常的Gitelman综合征患者血浆游离镁浓度是降低的，且血浆游离镁浓度与血浆碳酸氢盐之间存在显著相关性，但血浆游离镁浓度因检测手段等问题未能在临床广泛开展。

本病例的另一个特点是合并痛风性关节炎。已有报道显示，Gitelman 综合征合并假性痛风性关节炎，考虑为软骨钙质沉着症，这可能是因为尿钙排泄减少，增加了钙盐结晶沉积的概率，同时因为代谢性碱中毒及低镁血症导致焦磷酸酶活性下降，阻碍焦磷酸水解为无机的磷酸盐，加重焦磷酸盐结晶，沉积于关节周围并引起关节痛［16］。但Gitelman 综合征合并痛风性关节炎尚未见报道。MAIOLINO 等［17］检测了25 例Gitelman 综合征患者的血尿酸水平，结果发现所有患者的血尿酸水平均在正常范围，并且男性血尿酸平均水平高于女性。也有报道［18-19］显示Gitelman综合征患者合并低血尿酸水平。本例患者合并高尿酸血症，24 h 尿尿酸水平为2 128.0 μmol，尿酸排泄分数（血肌酐×24 h 尿酸/血尿酸×24 h 尿肌酐） 为1.88%，提示患者为尿酸排泄减少型高尿酸血症，考虑可能仍与NCCT 失活有关。患者远曲小管NCCT 失活，致远曲小管NaCl 重吸收减少，血容量下降，肾血流量代偿性增加，近曲小管NaCl 和尿酸盐重吸收增加。而钠和尿酸盐关联的具体机制尚不完全明确，有研究表明［20］，血容量不足和限盐摄入均可增加尿酸盐的重吸收，可能与近曲小管钠和尿酸盐的重吸收之间存在平行关系有关。尿酸盐通过多种阴离子交换蛋白进入细胞，包括尿酸盐-羟基交换蛋白和尿酸盐-乳酸交换蛋白，这2 个过程都依赖于钠的转运。而管腔膜上的Na+-H+交换蛋白负责大多数的近端碳酸氢盐重吸收。当钠重吸收增加时，Na+-H+交换增加，碳酸氢盐重吸收增加，细胞内环境比管腔内的碱性更强，细胞内较高的羟基浓度为羟基排出提供了有利梯度，羟基排出进而可促进尿酸盐重吸收。同样，当钠重吸收增加时，管腔膜上的钠-乳酸协同转运蛋白可介导乳酸进入细胞，这些乳酸随后通过尿酸盐-乳酸交换蛋白返回管腔，而尿酸盐被重吸收。

Gitelman 综合征的基因型中，纯合子基因型仅占18%，杂合子基因型占45%，复杂杂合子基因型占67%［21］。其基因型和表型的相关性研究有助于进一步了解NCCT 的功能，并为临床诊治提供参考。然而，基于不同研究的结果的不一致性，目前Gitelman综合征基因型与表型之间的关系尚不清楚。1996 年，Simon 等克隆了SLC12A3的cDNA，首次对人类NCCT进行了编码，并将其定位在具有26个独立外显子的人染色体16q13 上。NCCT 是肾远曲小管的主要离子转运系统，由1 021 个氨基酸残基组成，预测细胞内12 个跨膜结构域和较长的氨基和羧基端。现已发现［22］SLC12A3基因突变类型共有529 种，以错义突变及无义突变最多见，缺失突变和剪接位点突变较常见，插入突变较少见，另外还有插入缺失突变和复杂的基因重排等。一项纳入了137 例中国Gitelman 综合征患者的研究显示［23］，在发现的90 个突变中，错义突变占72%以上。T60M 及D486N 是中国患者最常见的氨基酸突变［9，11］，而IVS9+1G>T 是报道最多的欧洲人群中常见的突变［24］。在已发现的突变中，运用爪蟾卵母细胞表达系统仅对其中大约50 个突变进行了功能分析。研究发现，突变位点、突变类型、突变个数以及突变位置均影响临床表型。比如一些关键位点（糖基化位点和磷酸化位点）的突变可以直接影响NCCT 的活性及稳定性［25-27］，一些特殊位点的突变临床表型相对较轻，剪切突变、无义突变、移码突变、无功能性错义突变导致的临床表型较重［28］，携带2个突变的患者有更重的表型［4，29］，含有深部内含子突变的患者有相对更重的表型［28］。我们首次鉴定了复合杂合子变异体（c.1084G>A，p.G362S 和c.1850A>G，p.Q617R）。患者的母亲是一个变异（c.1084G>A）的携带者，而他的父亲是另一个变异的携带者（c.1850A>G）。然而，患者是家系中唯一表现出明显临床表现和患有Gitelman 综合征的成员。此类病例以前曾有报道［21，30］。在这些研究中，先证者携带复合杂合子变异体，其中一个变异体遗传自母亲，另一个遗传自父亲。然而，他们的父母都很健康。而该患者有正常血镁和高尿酸血症，是否提示新的突变位点与此有关呢？JIANG 等［4］的研究显示：7 例正常血镁患者携带13 个突变等位基因，其中12 个为胞内域突变，1 个为跨膜域突变，无胞外域突变；而25 例低镁血症患者有46 个突变等位基因，其中26 个位于胞内域，15 个位于跨膜域，5 个位于胞外域；结果提示正常血镁患者胞内域突变百分比明显高于低镁血症患者。本例患者SLC12A3基因的2 个突变位点编码的相应NCCT 氨基酸一个位于胞内域，一个位于跨膜域，与以往研究一致。然而，此新的突变位点与正常血镁及高尿酸血症的关系还需要进一步的体内外功能学研究来进一步证实和揭示。