血根碱通过上调m6A 甲基转移酶14 对胃癌细胞增殖和侵袭的抑制作用

陈 鸣，张 靖

上海交通大学医学院附属第六人民医院消化科，上海 200233

胃癌是常见的恶性肿瘤，虽然全球胃癌的发生率和死亡率在下降［1］，但是胃癌在我国仍位于恶性肿瘤死因的第3 位［2］。研究表明，除手术及放化疗外，传统中医药在抑制肿瘤转移和复发、改善患者预后等方面也具有一定的作用。血根碱（sanguinarine，SAG）提取自中药博落回（Macleaya cordata）及白屈菜（Chelidonium majus）等罂粟科植物。它是一种苯并菲啶类生物碱，具有广谱的生物学活性，包括抗氧化、抗炎、抗增殖与促凋亡等［3］。此外，SAG 可通过诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖、抗血管形成及转移等发挥抗肿瘤作用［4］：其可通过失活胞内磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB 或AKT）信号通路抑制急性淋巴细胞白血病发展和诱导细胞凋亡［5］，还可通过抑制SHH（sonic hedgehog）/GLI（gliotactin）/NANOG（Nanog homeobox）通路抗胰腺癌干细胞特性［6］。我们的前期研究［7-8］亦发现，SAG 可抑制胃癌的生长和侵袭。

N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）甲基化是真核生物中最常见的RNA 修饰方式，对mRNA 的转运、剪切、稳定和翻译具有重要作用［9-11］。m6A 甲基化修饰具有可逆性和动态性，由甲基转移酶［如甲基转移酶3/14（methyltransferase 3/14，METTL3/14）、WT1 相关蛋白（WT1 associated protein，WTAP）等］起始，去甲基化酶［如肥胖相关 蛋 白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）、 烷 基 化 修 复 同 源 物5 （alkylation repair homolog 5，ALKBH5）等］还原及识别子［YTH 结构 域 家 族 蛋 白1/2/3 （YTH domain family 1/2/3，YTHDF1/2/3） 和 YTHDC1/2 （YTH domain containing 1/2）］ 共同调控完成［12］。研究表明，METTL14通过m6A 甲基化修饰抑制造血干/祖细胞分化和促进白血病发生［13］，以及通过上调与PMP-22相关的P53 效应因子（P53 effector related to PMP-22，PERP）mRNA 的m6A 甲基化水平促进胰腺癌生长和转移［14］。但同时也有多项研究发现METTL14对部分肿瘤表现出抑制作用。YANG等［15］发现METTL14可以通过下调癌基因长链非编码RNAXIST（X inactive specific transcript）抑制结直肠癌的增殖和转移；另有研究［16］发现，其通过调节PI3K/AKT/mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白， mammalian target of rapamycin）信号通路抑制胃癌的增殖、侵袭和迁移。本研究通过观察SAG 对METTL14表达及胃癌生长、侵袭的影响，初步探索SAG 抗胃癌的分子机制，为胃癌的治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂和仪器 SAG（纯度≥99%）购自上海源业生物科技有限公司，噻唑蓝（MTT）购自江苏凯基生物技术股份有限公司，TRIzol试剂购自美国Invitrogen 公 司， METTL14 的 小 干 扰RNA （si-METTL14）慢病毒载体及其空载对照si-NC慢病毒载体购自上海吉凯生物科技有限公司，反转录试剂盒和SYBR Green Master Mixture 试剂盒购自日本TaKaRa公司，Transwell 试剂盒购自美国BD 公司，抗METTL14 抗体［CL4254］（货号ab220031）购自美国Abcam 公司， 抗甘油醛-3- 磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（货号AB-P-R 001）购自杭州贤至生物技术有限公司。PCR 引物由上海吉玛制药技术有限公司合成。

实时荧光定量PCR 仪（型号MA-6000）购自美国Kray Technologies 公司，酶标分析仪（型号BS-1101）购自美国Bio-Rad 公司。紫外可见分光光度仪（型号V-5100）购自上海元析仪器有限公司。

1.1.2 胃癌细胞系 人胃癌细胞系MGC-803、AGS均购自中国科学院细胞库。

1.2 实验方法

1.2.1 SAG 处理细胞 用不同浓度SAG（0、10、20 μmol/L）处理胃癌细胞（MGC-803、AGS）48 h后，进行后续实验。

1.2.2 定量PCR TRIzol 提取细胞总RNA，并反转录为cDNA，使用SYBR Green Master Mixture 试剂盒进行cDNA 扩增。METTL14上、下游引物序列分别为5′-GAACACAGAGCTTAAATCCCCA-3′和5′-TGTCAGCTAAACCTACATCCCTG-3′。以人β 肌动蛋白（β-actin）为内参对照，上、下游引物序列分别为5′-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3′和5′-CCTGTAACAACGCATCTCATATT-3′。扩增条件：93 ℃2 min预变性；然后按93 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，共40 个循环；最后72 ℃7 min 延伸。每个样品重复3次。

1.2.3 Western blotting 将约5×107个细胞培养过夜后，裂解细胞，提取蛋白，4 ℃14 170×g离心15 min，上样20 μL进行电泳；电转至PVDF膜后封闭。先后滴加METTL14一抗、辣根过氧化物酶标记二抗。化学发光底物加于PVDF膜上，凝胶成像系统照像。GAPDH蛋白二次杂交。70 ℃水浴洗膜30 min 后用同法以GAPDH 作为内参对照，用紫外可见分光光度仪测量METTL14与GAPDH每个杂交图像峰面积值，两者峰面积值的比值代表METTL14蛋白的相对表达量。

1.2.4 慢病毒转染 在250 mL 细胞培养瓶中接种约1×105个细胞，培养过夜后等待细胞贴壁，按胃癌细胞的慢病毒感染复数（multiplicity of infection，MOI）值100，加入si-METTL14或si-NC 慢病毒载体感染胃癌细胞，48 h后换用含嘌呤霉素的培养液进行抗性筛选7 d，然后以10 μmol/L SAG 或PBS 处理48 h。根据加入的慢病毒载体和处理的药物将细胞分为si-METTL14+SAG组、si-NC+SAG组和si-NC+PBS组。

1.2.5 MTT 增殖实验 通过MTT 增殖实验检测si-METTL14+SAG 组、si-NC+SAG 组和si-NC+PBS 组细胞的增殖水平，具体实验方法参考文献［17］。实验重复3次。

1.2.6 克隆形成实验 SAG 作用1 周，取si-METTL14+SAG 组、si-NC+SAG 组和si-NC+PBS 组处于对数生长期的细胞，胰酶消化并制备单细胞悬液，以每孔约1 000 个细胞接种于6 孔板，置于培养箱中培养，隔天换液。观察细胞增殖情况，当6 孔板中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，PBS漂洗2 次。每孔加入4%多聚甲醛2 mL 固定细胞15 min。弃去固定液，加适量的结晶紫染液染色15 min，PBS 漂洗2 次，晾干后拍照并计数。实验重复3次。

1.2.7 Transwell侵袭实验 通过Transwell侵袭实验检测si-METTL14+SAG组、si-NC+SAG组和si-NC+PBS组细胞的侵袭能力，具体实验方法参考文献［17］。实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 SAG对胃癌细胞中METTL14表达的影响

利用不同浓度SAG（0、10、20 μmol/L）处理胃癌细胞（MGC-803、AGS） 48 h 后，定量PCR 和Western blotting 结果显示，与对照组（0 μmol/L）比较，SAG 明显上调METTL14的表达水平（均P<0.05），且呈一定浓度依赖性，仅AGS 细胞中20 μmol/L SAG 在蛋白水平未表现出明显的上调作用（图1）。

图1 不同浓度SAG对胃癌细胞中METTL14表达的影响Fig 1 Effect of different concentrations of SAG on METTL14 expression in gastric cancer cells

2.2 敲减METTL14 对SAG 抑制胃癌细胞增殖的影响

si-METTL14载体或si-NC载体转染胃癌细胞（MGC-803、AGS） 后，定 量PCR 和Western blotting 检 测METTL14mRNA和蛋白的表达水平（图2A、B），发现si-METTL14载体显著抑制了METTL14的表达（均P<0.01）。

MTT 增殖实验结果显示，si-NC+SAG 组胃癌细胞（MGC-803、AGS）增殖水平与si-NC+PBS 组比较被显著抑制（均P=0.000），而si-METTL14+SAG组SAG 的抑制作用被部分逆转，细胞增殖水平高于si-NC+SAG 组，低于si-NC+PBS 组，差异均有统计学意义（均P<0.05，图2C）。

图2 敲减METTL14对SAG抗胃癌细胞增殖作用的影响Fig 2 Effect of knocking down METTL14 on the anti-proliferation activity of SAG in gastric cancer cells

2.3 敲减METTL14 对SAG 抑制胃癌细胞克隆形成的影响

克隆形成实验结果显示，与si-NC+PBS 组比较，si-NC+SAG 组胃癌细胞克隆形成能力被显著抑制（均P<0.01）；而与si-NC+SAG 组比较，si-METTL14+SAG 组SAG 的抑制作用被部分逆转，细胞克隆数显著增加（均P<0.05，图3）。

图3 敲减METTL14对SAG抗胃癌细胞克隆形成的影响Fig 3 Effect of knocking down METTL14 on the anti-colony formation capability of SAG in gastric cancer cells

2.4 敲减METTL14 对SAG 抑制胃癌细胞侵袭能力的影响

Transwell 侵袭实验显示，与si-NC+PBS 组比较，si-NC+SAG 组胃癌细胞的侵袭能力被显著抑制（ 均P<0.01）； 而 与si-NC+SAG 组 比 较， si-METTL14+SAG 组SAG 的抑制作用被部分逆转，穿过基底胶（Matrigel） 的细胞数显著增多（均P<0.05，图4）。

图4 敲减METTL14对SAG抗胃癌细胞侵袭潜能的影响Fig 4 Effect of knocking down METTL14 on the anti-invasion potential of SAG in gastric cancer cells

3 讨论

肿瘤侵袭转移是胃癌患者预后不良的主要原因之一。m6A甲基化修饰异常与胃癌预后及侵袭转移密切相关。METTL3 和METTL14 都是m6A 甲基转移酶的主要构成部分，但两者对胃癌却显现出相反的作用。METTL3 可介导肝癌衍生生长因子（hepatomaderived growth factor，HDGF）的m6A 甲基化修饰或通 过 METTL3/ZMYM1 （zinc finger MYM-type containing 1）/E-cadherin（上皮钙黏素）信号促进胃癌的上皮间质转化 （epithelial-mesenchymal transition，EMT）、血管生成和转移，而且是胃癌的一个潜在的预后生物标志物和治疗靶点［18-19］。m6A去甲基化酶FTO 通过抑制β1 整合素（integrin subunit β1，ITGB1）的m6A 甲基化修饰促进胃癌转移［20］，且高表达FTO 和ALKBH1 与胃癌不良预后密切相关，是胃癌患者预后的潜在标志物［21］。我们前期研究［12］发现，识别子YTHDF1 以m6A 依赖的方式介导去泛素 化 酶14 （ubiquitin-specific proteases 14，USP14）的翻译，促进胃癌的发生和转移［22］。这些研究阐述了m6A甲基化修饰与胃癌之间的关系。

我们前期研究［7］还发现，SAG 通过调节双特异性 磷 酸 酶4 （dual specificity protein phosphatase 4，DUSP4）/细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）通路抑制胃癌细胞生长和侵袭。ZHU 等［23］人发现SAG 通过WNT/β-catenin 信号通路抑制与EMT 相关结肠癌的迁移和转移。另有研究［24］揭示了SAG通过上调胰岛素样生长因子结合蛋白-3 （insulin like growth factor binding protein-3，IGFBP-3）的表达促进肝癌细胞的凋亡。SAG 在多种消化系统肿瘤中均显示出良好的抗癌潜力，但是其具体作用机制仍有待进一步阐明。

本研究结果显示，不同浓度SAG对2种胃癌细胞株中的METTL14表达具有上调作用，且浓度越高，上调作用越明显；同时SAG 可以抑制胃癌细胞的增殖活性、克隆形成及侵袭潜能，但是敲减METTL14对SAG 的这些效果具有部分逆转作用；由此推测，SAG 可能通过上调METTL14抑制胃癌细胞的生长和侵袭。后续本课题组将进一步分析METTL14在人体胃癌及癌旁组织标本中的表达水平，以及METTL14的表达量与胃癌侵袭转移、病理分级、临床分期及预后的关系。