分子杂交技术检测CYP2C19*2/*17 基因多态性及其应用

肖春红，曹红艳，许亮亮，袁建芬，喻海忠

（1 南通大学附属肿瘤医院/南通市肿瘤医院检验科，江苏 226361；2 南通市中医院检验科）

心血管病为目前全球人群死亡的首要原因，随着我国人口老龄化和城镇化步伐的加快，心血管病发病率和患病率持续上升[1]。动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)常用抗凝及抗血小板聚集药物治疗，由于未进行基因分型，部分患者疗效欠佳。本研究选择南通市中医院2019 年11 月—2020 年12 月就诊的拟采用氯吡格雷治疗的动脉粥样硬化患者331例，采用分子杂交技术检测与氯吡格雷药物代谢有关的CYP2C19*2/*17 基因多态性，为临床用药提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 拟采用氯吡格雷治疗的动脉粥样硬化患者331 例，其中男性193 例，女性138 例，年龄32～101 岁。本研究经医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 设备与试剂 IANLONG BHS-1 恒温水浴锅(群安实验仪器有限公司)，Fanscan 48s 多通道荧光定量分析仪(西安天隆科技有限公司)，G16B 医用离心机(盐城市凯特实验仪器有限公司)，XK-400 型医用离心机(江苏新康医疗器械有限公司)。核酸提取和纯化试剂、地高辛染液(广州海思医疗器械有限公司)。

1.3 实验方法

1.3 .1 富集白细胞收集：取30 μL EDTA-K2抗凝全血，加入300 μL 2%冰酸酸溶液中混匀，3 min 后1 500 r/min 离心3 min。取沉淀加入无菌生理盐水500 μL，混匀后1 500 r/min 离心3 min，重复3 次。最后取沉淀加入无菌生理盐水30 μL 混匀，取5 μL加入预处理液95 μL，混匀，65 ℃15 min，95 ℃10 min，然后12 000 r/min 离心2 min，置于0 ℃备用。

1.3 .2 分子杂交实验：取200 μL 的8 联管，加入18 μL地高辛染色液，然后在对应管中分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各2 μL。采用Fanscan 48s 多通道荧光定量分析仪，打开检测项目名称，进行样品序列编辑，按样品编号与阴、阳性质控进行编号，点击运行试验。结束后进入分析结果界面，选择对应孔查看，如出现检测失败，则需复查，阴性质控与阳性质控必须正确才能判定结果。

1.3 .3 试剂性能检测：(1)准确性：采用一代测序与分子杂交技术同时对20 例样本CYP2C19*17 和CYP2C19*2 位点进行检测比对。(2)稳定性：①冻融稳定性：取含CYP2C19*17 或CYP2C19*2 位点的地高辛染色液，轮流置于室温和-20 ℃之间进行冻融，分别于0、3、6、9、10 次冻融后对W、M、N、H 质控及10 号样本进行检测。②加速稳定性：取含CYP2C19*17或CYP2C19*2 位点的地高辛染色液置于37 ℃，分别于第4、5、7 天对W、M、N、H 质控及10 号样本进行检测。

2 结 果

2.1 CYP2C19*2/*17 基因多态性 检测结果显示，331 例患者中CYP2C19*2/*17 基因存在超快代谢型(UM，*1/*17、*17/*17)、快代谢型(EM，*1/*1)、中间代谢型(IM，*1/*2、*2/*17)和慢代谢型(PM，*2/*2)4种药物代谢型，其中19 例(5.74%)为超快代谢型，142 例(42.90%)为快代谢型，131 例(39.58%)为中间代谢型，39 例(11.78%)为慢代谢型，中间代谢型和慢代谢型共占51.36%。见表1、2。

表1 分子杂交法检测CYP2C19*2/*17 基因多态性

表2 基因型与代谢表型对照

2.2 分子杂交准确性 对20 例样本进行一代基因测序，结果与分子杂交完全一致，表明分子杂交技术检测CYP2C19*17 基因和CYP2C19*2 基因的准确性为100%。见表3。

表3 20 例样本CYP2C19*17 及CYP2C19*2 基因检测结果

2.3 分子杂交检测试剂稳定性 CYP2C19*17 基因和CYP2C19*2 基因位点的分子杂交检测试剂经10次反复冻融及置于37 ℃7 天加速后，均能100%准确检测出W、M、N、H 质控及10 号样本对应位点的基因型，表明检测试剂稳定性良好。见表4、5。

表4 W、M、N、H 质控及10 号样本CYP2C19*2及CYP2C19*17 位点冻融稳定性检测

表5 CYP2C19*2 及CYP2C19*17 位点加速稳定性检测

3 讨 论

降脂及抗凝治疗是ASCVD 重要治疗方法，对用药后血脂正常的患者以抗凝治疗为主。应实行个体化药物治疗，以达到精准治疗的目的。目前常规采用凝血指标对抗凝药物使用进行监测，仅用来防止患者用药过度造成出血倾向，因此需要寻找确保ASCVD 患者抗凝药物治疗有效性的检测手段。临床上常采用阿司匹林与P2Y12 拮抗剂组成的双联抗栓治疗[3-8]，阿司匹林主要针对环氧化酶，抑制花生四烯酸反应，降低血栓烷素A2、前列腺素含量水平，促使血管扩张和抑制血小板聚集。硫酸氢氯吡格雷是一种P2Y12 拮抗剂，抑制ADP 与其受体结合,同时阻断ADP 活化血小板。氯吡格雷作为前体药物，需要通过体内代谢转变成活化的硫酸氢氯吡格雷才能发挥抗凝作用，而CYP2C19 是调控氯吡格雷活化的关键酶。

CYP2C19 是一种药物代谢酶，以CYP2C19*2 和CYP2C19*17 最常见，其基因多态性与氯吡格雷在体内的代谢转化关系密切。临床上常采用CYP2C19基因位点检测来预测氯吡格雷的疗效，为临床调整用药提供帮助，避免心血管事件的发生[9-10]。氯吡格雷药物代谢分为四种表现型，中间代谢型与慢代谢型由于药物代谢缓慢，从而导致疗效欠佳，故CPIC指南(2013 年)建议在无禁忌证的情况下，CYP2C19中间代谢型或慢代谢型患者应考虑使用替格瑞洛或普拉格雷进行抗血小板治疗。荷兰药物遗传学工作组(DPWG)指南(2018 年)也作出与CPIC 指南一致的建议，但同时建议CYP2C19 中间代谢型患者可考虑在氯吡格雷600 mg 负荷剂量后将维持剂量加至150 mg/d。

对CYP2C19 基因多态性的分析可确定其药代类型，常应用基因测序法及实时荧光PCR 方法进行检测[11-13]，但需要具有实验室及检测人员相应资质，而分子杂交技术可替代成为基层医院实验室检测工具。本研究采用分子杂交技术，对331 例动脉粥样硬化患者血标本进行检测，结果显示19 例(5.74%)超快代谢型，142 例(42.90%)快代谢型，131 例(39.58%)中间代谢型，39 例(11.78%)慢代谢型，中间代谢型和慢代谢型占51.36%，如果不进行CYP2C19 基因多态性检测，这些患者会出现氯吡格雷错误用药，可能影响药效。本研究结果显示，分子杂交技术检测结果与一代测序完全一致，试剂反复冻融及加速稳定性均符合要求，表明分子杂交技术不失为一种方便、快速、准确检测氯吡格雷相关药物基因的实验方法。