重组人血管内皮抑制素联合放射治疗对A549 肺腺癌裸鼠移植瘤抗肿瘤效应研究*

杨百霞，杨燕光，刘 春，翟小刚，葛杨杨，曹 飞

（1 南通大学附属肿瘤医院/南通市肿瘤医院放疗科，江苏 226361；2 南通大学实验动物中心）

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占全部肺癌的80%，是我国最常见的恶性肿瘤之一[1]，寻找新的联合方案以提高疗效是近年研究的热点。重组人血管内皮抑制素(恩度，Endostar)为血管形成抑制因子[2]，能有效抑制病理性血管的形成，达到诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长和转移的目的[3-4]。研究证实抗血管靶向治疗具有增强放疗的作用[5-6]。本研究采用A549 肺腺癌裸鼠模型，观察放疗与重组人血管内皮抑制素不同联合模式的抑瘤效应及其对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、微血管密度(microvessel density，MVD)的影响，为临床治疗NSCLC 提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂 含10%胎牛血清完全型PPMI 1640 培养基(杭州天杭生物科技有限公司)，重组人血管内皮抑制素注射液(恩度)(江苏先声药业有限公司)，人肺腺癌细胞株A549(中国科学院上海生科院细胞资源中心)。VEGF、CD105 标记的MVD 单克隆抗体(CD105-MVD)、羊抗鼠标记二抗(美国Santa Cruz 公司)，PV-6000 通用免疫组化检测试剂盒(北京欣兴唐生科技有限公司)。

1.2 实验动物 雄性BALB/c 裸鼠，体重(18±2)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[生产许可证：SCXK(沪)2012-0002，合格证号：0187705]，于南通大学实验动物中心[使用许可证：SYXK(苏)2012-0031]饲养于SPF 环境EVC 笼盒内，湿度(55±5)%，温度(23±2)°C，自由饮食和饮水，定期更换笼具、垫料，采用14∶10 h 明暗交替照明。

1.3 实验方法

1.3 .1 荷瘤小鼠模型建立及分组：收集培养的人肺腺癌A549 细胞，以PBS 重悬，调整细胞浓度为7.5×106/mL，用医用注射器将0.2 mL A549 细胞悬液接种于裸鼠背部皮下脂肪垫。接种10 天后开始成瘤，形成肉眼可见肿瘤，将裸鼠随机分为5 组，每组5 只，各组裸鼠体重、肿瘤直径比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。按分组进行相应处理，空白对照组：裸鼠瘤周皮下注射0.9%氯化钠溶液0.2 mL/d，连续14天；恩度组：瘤周皮下注射恩度400 μg/d，连续14天；恩度联合放疗组(联合组)，根据放疗时机不同分为3 个亚组，恩度使用方法与恩度组相同，联合1 组于d 1、d 3 接受放疗，联合2 组于d 5、d 7 接受放疗，联合3 组于d 9、d 11 接受放疗。

1.3 .2 放疗：将小鼠装入特制的50 mL 无菌试管，尽量控制小鼠活动，暴露肿瘤部位。根据肿瘤大小设置照射野，并用挡铅保护正常组织和器官。采用9 meV电子线，垂直照射肿瘤区域，DT：10 Gy/次，隔日照射2 次。

1.4 观察指标 (1)裸鼠一般情况。(2)抑瘤率：每天测量小鼠肿瘤直径，计算肿瘤体积，肿瘤体积=(肿瘤长径×肿瘤短径2)/2。抑瘤率=(对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100%。治疗结束后第10 天，处死裸鼠，取出瘤块，测定肿瘤重量，计算肿瘤体积。(3)病理学检查：取裸鼠肿瘤组织作病理切片，HE 染色，光镜下观察肿瘤组织病理结构。(4)肿瘤组织VEGF 表达及MVD：采用免疫组化法检测VEGF 表达，VEGF 阳性定位在细胞质，呈棕黄色颗粒。免疫组化计分：每例切片至少计数10 个100 倍视野，阳性细胞数＜1%为0 分，1%～25%为1分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分。按染色强度计分，淡棕褐色计1 分，棕褐色计2 分，深棕褐色计3 分。以两者之和进行判定，得分≤2 分为阴性，＞2分为阳性。由5 名技术员分别对每组进行免疫组化计分，取平均值。CD105 标记的MVD 阳性表达定位于新生血管内皮细胞膜上和(或)细胞浆中，呈棕黄色颗粒。以低倍镜下(10×)确定每个切片中3 个肿瘤血管密度为最高区域，然后调整至高倍镜(40×)，观察3 个高倍视野内的微血管数，取其平均值作为MVD 值。

1.5 统计学处理 应用STATA 7.0 统计学软件进行数据分析，应用GraphPad Prism 5.0 软件进行统计作图。计量资料以±s 表示，组间差异性比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组裸鼠一般情况 各组裸鼠成瘤率均100%。空白对照组裸鼠进食、活动正常，精神状态良好，有3 只裸鼠肿瘤部位皮肤轻微破裂；恩度组裸鼠给药期间进食及活动状况良好，有1 只裸鼠肿瘤表面皮肤溃烂；联合组裸鼠在放疗后均出现食欲下降以和精神状态不佳，但于放疗结束后数日恢复常态。

2.2 各组抑瘤率比较 治疗第1～7 天各组肿瘤体积无明显变化，从治疗第7 天起空白对照组肿瘤体积明显增大，生长曲线陡直，恩度组肿瘤体积增速次之，联合各亚组肿瘤生长较缓慢，其中联合2 组肿瘤体积增加最慢。见图1。裸鼠处死后测量显示，肿瘤质量和体积恩度组小于空白对照组，联合各亚组小于空白对照组和恩度组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，其中联合2 组抑瘤率最高，达到77.8%。见表1。联合1、联合2、联合3 各亚组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。

图1 各组裸鼠肿瘤体积变化曲线

表1 各组荷瘤裸鼠抑瘤率比较

2.3 各组肿瘤组织病理学观察 空白对照组肿瘤细胞呈巢团状排列，细胞核大且异形，符合肺腺癌病理改变。恩度组部分肿瘤细胞出现粘液变性。联合各亚组肿瘤细胞变性显著，并出现不同程度坏死脱落，各亚组间病理学改变无明显差异。见图2。

图2 各组肿瘤组织病理改变（HE 染色，20×）

2.4 各组VEGF 表达及MVD 比较 与空白对照组比较，恩度组、联合1 组、联合2 组、联合3 组VEGF表达降低，MVD 减小，差异均有统计学意义(P＜0.05)，但联合1、联合2、联合3 各亚组间比较，VEGF 表达及MVD 的差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表2、图3。恩度组与联合1、联合2、联合3亚组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表2 各组肿瘤组织中VEGF 表达及MVD 比较

图3 各组CD105 显示的微血管（40×）

3 讨 论

肺癌发病率和死亡率在我国居恶性肿瘤第一位[7]，75%～85%患者确诊时已失去手术治疗机会，近年来肺癌治疗取得明显进步，但总体疗效仍不尽人意[8]。肿瘤生长和转移有赖于肿瘤新生血管的形成，新生血管与肿瘤细胞生长、浸润和转移密切相关[9-10]。通过抑制肿瘤新生血管，切断肿瘤血供，从而抑制肿瘤生长，促使肿瘤细胞凋亡和坏死。近年来研究表明，恩度联合放疗有明确的增敏作用[10]，可能与阻滞细胞周期[11]、调控VEGF、HIF-1 等血管生成因子表达相关[12-13]。

本研究结果显示，空白对照组肿瘤体积增大快速，生长曲线陡直，恩度组肿瘤体积增速次之，而联合各亚组肿瘤生长较缓慢，其肿瘤质量和体积明显小于空白对照组和恩度组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，其中联合2 组抑瘤率最高，说明恩度联合放疗能有效抑制肿瘤生长。组织病理学分析发现，联合组肿瘤细胞出现明显的变性和坏死，可能与恩度能有效抑制VEGF 表达，降低MVD，减少肿瘤组织血供，增敏放疗作用有关。联合1、联合2、联合3 各亚组间VEGF 表达及MVD 比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)，提示用药后不同时间点照射与VEGF 表达及MVD 无明显相关性。