低共熔溶剂提取厚朴渣中木脂素类化合物

王 帆，简雅婷，张 宇，陈小燕，余 强

（1. 中国科学院广州能源研究所，广州 510640； 2. 中国科学院大学，北京 100039； 3.中国科学技术大学，合肥230000； 4.华南农业大学生物质工程研究院，农业农村部能源植物资源与利用重点实验室，广东省农林生物质工程技术研究中心，广州 510642）

0 引 言

近年来，随着国内外依赖中药和天然药物资源为原料的大健康产业迅猛发展，药渣产生量剧增，但由于提取工艺、设备和管理因素的制约，药渣等废弃物未能得到有效利用，不仅造成资源浪费，且导致生态环境的严重污染。Li等对黄芪废渣成分进行了鉴定，刘常青等比较了丹参药材与丹参药渣中丹参酮ⅡA的含量，Biltekin检测了橄榄渣中存在的一些有价值的生物活性化合物，在最佳条件下获得的山楂酸和齐墩果酸总量为26 mg/g干物质，相当于提取物的98.21%。以上结果均说明中药渣仍有较大的再利用价值。通常中药的提取溶媒为水溶液，其药渣中还残存有大量的脂溶性成分，资源的浪费问题更为突出。厚朴是中国三木药材（厚朴、杜仲和黄柏）之一，具有抗菌、抗炎镇痛、抗肿瘤、中风和哮喘等主要临床药理作用；其主要成分为木脂素类物质、包括厚朴酚（Magnolol）、和厚朴酚（Honokiol），异厚朴酚、三羟基厚朴酚、去氢三羟基厚朴酚，其中和厚朴酚、厚朴酚是厚朴药材中含量最高的有效成分，是评价厚朴药材质量的标准检测物。药理试验证明两者具有松弛骨骼肌、杀虫、杀菌、中枢抑制和抗溃疡等作用。从厚朴渣中再提取木脂素类化合物极具应用前景和意义，不仅能减少环境污染，而且能带来一定的社会经济效益，目前已成为生物质资源与环境行业研究的热点。

传统中药成分提取工艺以煎煮为主，此过程能够溶解部分水溶性功效成分，厚朴渣中仍残留较多有效成分。作为典型的厚朴功效成分，厚朴木脂素类化合物的提取与利用一直备受关注。已有提取方法主要为醇提、水提、碱溶酸沉法等，这些方法操作简单、无需复杂设备，是目前工业中主要使用的方法。然而这些方法也存在许多问题，如溶剂使用量大、提取时间长、提取温度高等。因此，寻找一种高效、绿色、易制备提取溶剂对中药渣中残留功效成分的提取具有重要意义。低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvent，DES）是由两个或多个组分形成氢键作用形成的共晶混合物，因其在常温下呈液体状态，且具有与传统溶剂相近的功能，引起广泛关注。DES的组分包含氢键供体（Hydrogen Bond Donor，HBD）与氢键受体（Hydrogen Bond Acceptor，HBA），可被生物降解，符合绿色化学的要求，同时，DES制备过程简单、可设计性强，有望成为传统溶剂的绿色替代品。DES较常规溶剂渗透能力强，通过辅助分解植物细胞壁木质素、半纤维素及纤维素，使活性成分的溶出率增加。熊颖等发现采用氯化胆碱/草酸可有效提取多酚类化合物，提取率为常规甲醇溶剂的2倍以上；Cui等应用微波加热方法辅助低共熔溶剂提取黄酮类化合物，黄酮提取率较传统水热浸提提高100%以上；Chanioti等发现柠檬酸/氯化胆碱所提取的总酚含量和抗氧化活性均高于均质化、微波、超声波和高静水压力辅助等方法。此外，DESs可回收再利用，如利用醋酸钠和乳酸合成的NADESs提取玉竹中的黄酮提取量为20.13 mg/g，回收利用一次提取量仍有18.79 mg/g；Zhang等重复利用氯化胆碱/草酸提取茯苓多糖，重复6次后其提取率为38.40%，较传统的热水提取提高了7.2倍。DES组成成分对中药功效成分的提取效率影响较大，中药功效成分的结构差异也显著影响提取率。因此，了解提取过程中溶剂与溶质间相互作用机理，将对改善提取反应效率具有重要的指导作用。

本试验以厚朴渣为提取研究对象，考察多种DES对厚朴渣中残留木脂素类化合物的提取效率，筛选得到最优溶剂，考察主要影响因素对和厚朴酚、厚朴酚的提取率变化，优化提取工艺，旨在提高木脂素类化合物提取效果，为有效利用厚朴渣及拓展 DES应用领域提供理论支撑。最后，利用密度泛函理论对提取过程进行模拟与量子化学分析，研究低共熔溶剂与木脂素类化合物的相互作用，揭示复合体系组分之间相互作用关系，以期为设计高效提取溶剂提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

厚朴原料购买于神龙百草行经方药材店（产地：四川），粉碎过筛，取300 g 20～40目（425～850m）颗粒大小厚朴粉用1.5～2.0 L去离子水煮沸半小时后于烘箱烘干至恒质量，得到干物质厚朴渣为后续试验原料。和厚朴酚、厚朴酚标准品购于上海源叶生物科技有限公司，其他试剂购自上海麦克林生化科技有限公司，均为分析纯。

1.2 DES的制备

DES组成参照表1，以氯化胆碱（Choline Chloride，ChCl）等为HBA，以一元酸、二元酸、二元醇等为HBD，按相应摩尔比制备10种DES。制备方法参照Abbott等方法，将 HBA与HBD混匀于厚壁耐压瓶中，搅拌加热至80～90 ℃约30～60 min，形成透明澄清的液体，密封保存备用。

1.3 不同DES对功效成分的提取效率比较

考察10种DES对厚朴渣中厚朴酚、和厚朴酚的提取效率，参照文献报道，选取固液比1∶15 g/mL，将2 g厚朴渣与30 mL DES混匀于微波提取器，放入常压微波反应器（MCR-3常压微波反应器，广州市星烁仪器有限责任公司）中进行提取反应，反应条件设置功率160 W、温度50 ℃、反应时间30 min。反应结束后，反应物进行抽滤，残渣用水冲洗干净后烘干至恒质量，清液用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）检测提取物中各木脂素类化合物的含量。

表1 本试验中所用低共熔溶剂Table 1 Deep Eutectic Solvents (DES) used in present study

1.4 不同反应因素对提取率影响的试验设计

选取1.3中最佳提取溶剂，在不同反应时间（30、60、90、120 min）与反应温度（30、50、70、90 ℃）条件下，分别对固液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25与1∶30 g/mL）、溶剂含水率（30%、40%、50%）、DES组成摩尔比（1∶2、1∶3、1∶4），进行单因素变量替换工艺流程中相应的常规量，考察各因素对木脂素类化合物提取效果的影响，以上每个处理均重复3次。同时，参考中国药典中的厚朴提取方法，以甲醇作为溶剂代替低共熔溶剂，精密称取0.2 g厚朴渣，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，浸渍24 h，考察其对厚朴渣中木脂素类化合物提取率。

1.5 分析方法

1.5.1 木脂素类化合物含量检测方法

和厚朴酚、厚朴酚的含量检测采用HPLC方法，液相色谱仪器型号为Alliance2695（Waters，USA），分离柱选用Waters XBridge BEH C18柱，柱温30 ℃，进样体积10L，流动相为甲醇∶超纯水=78∶22（体积比），流速0.80 mL/min，示差检测器2414的检测波长：294 nm。以标准厚朴酚、和厚朴酚质量浓度（mg/mL）为纵坐标，时间（min）为横坐标，绘制标准曲线，分别得出厚朴酚、和 厚 朴 酚 的 回 归 方 程 为=1.51×10+3.42×10，=0.999 521，=1.66×10+3.32×10，=0.999 547，线性相关性良好。根据标准曲线计算出木脂素类化合物提取率（Extraction yield，mg/g）计算公式如下：

式中为提取溶液中木脂素类化合物的浓度，mg/mL；为提取溶液的体积，mL；为厚朴渣的质量，g。

1.5.2 DES提取木脂素类化合物的量子化学分析

DES的HBD和HBA初始猜测构型由gaussview软件得到。以ChCl分别与有机酸类、醇类形成的DES的构象优化在M06-2X/6-311G**（**表示对该基组加一套d、p轨道的极化函数）的水平上进行，并通过虚频检验保证获得最稳定构型。利用密度泛函理论gaussian16 对DES进行单电能和频率优化，得到能量最低的稳态结构，运用 Multiwfn和Vmd软件计算分子表面静电势（Electrostatic Potential，ESP）和约化对比梯度密度（Reduced Density Gradient，RDG），分析DES的HBD和HBA分子间相互作用，分析DES的形成机理。RDG（无量纲的形式）分析采用约化密度梯度函数。

2 结果与分析

2.1 DES体系的选择

DES配位剂组成会显著影响植物活性物质的溶出，配置合成不同组分的混合物，其理化性质有较大的差异，考察了10种不同酸类、酮类物质为HBD的DES对厚朴渣木脂素类化合物提取能力。分析结果（图1）显示，氯化胆碱/乙酰丙酸（ChCl-La，DES-8）DES对厚朴渣中木脂素类化合物总提取率最高为20.31 mg/g，推测与ChCl-La破坏细胞膜结构的能力有关。

图1 不同DES的总木脂素类化合物的提取效果Fig.1 Extraction yield of total lignanoids by different DES

氯化胆碱/乙酸（ChCl-AC，DES-9）、氯化胆碱/乳酸（ChCl-Lac，DES-6）对木脂素类物质的提取效果仅次于ChCl-La溶剂，总提取率分别为19.69、14.95 mg/g，其余以氯化胆碱为HBA的DES对木脂素类化合物提取效果较低。其中ChCl-Ur （DES-1）、MTAC-EG（DES-2）与ChCl-MEA（DES-3）提取液中未检测到厚朴酚成分，ChCl-PA（DES-10）提取液中未检测到和厚朴酚成分，故分别只计算对应提取到物质的提取率。根据试验结果，选择ChCl-La作为后续的研究对象。

2.2 固液比对木脂素提取率的影响

选取ChCl-La用于后续试验中的厚朴渣中木脂素类化合物提取，分析固液比在不同反应温度（30～90 ℃）、反应时间（0.5～2 h）对木脂素类化合物提取效果的影响。结果显示（图2），两种目标化合物的提取率先增大后减小，当固液比为1∶25 g/mL时，总提取率平均值达到最高（32.87 mg/g），和厚朴酚、厚朴酚的提取率分别为9.93、22.95 mg/g。随着溶剂用量的增加，目标化合物与溶剂充分接触，萃取效果较好，当溶剂过多时会造成浪费，增加试验成本，甚至不利于目标化合物的萃取。从图中可以看出，固液比为1∶10 g/mL，温度在50～90 ℃范围内变化时，厚朴酚、和厚朴酚的提取率增幅较小，当固液比增加至1∶15 g/mL，时间在1～2 h之间时，随着温度的升高，厚朴酚、和厚朴酚的提取率在逐渐增加；而当固液比增加到1∶25 g/mL时，厚朴酚、和厚朴酚的提取率有了大幅提升，再次增加固液比至1∶30 g/mL时，目标化合物的提取率整体开始迅速下降，可能是因为溶剂的大量增加，造成目标提取物的浓度降低，使提取效率降低。因此，在下一步试验中选择1∶25 g/mL固液比进一步研究。

2.3 溶剂含水率对木脂素提取率的影响

试验研究了相同的微波辅助提取条件下，溶剂含水率为30%、40%、50%对厚朴渣中两种木脂素类化合物的提取率的影响（图3）。总体而言，随着含水率的增加，厚朴酚、和厚朴酚的提取率逐渐下降。当含水率为30%时，总提取率最高（32.87 mg/g），并且随着温度的升高和时间的延长，两者的提取率均呈现逐步增加的趋势。当含水率增至40%和50%，厚朴酚、和厚朴酚的提取率迅速下降，总提取率25.22 mg/g下降到14.44 mg/g。原因可能是高含水率会增加萃取介质的极性，破坏了ChCl-La溶剂与厚朴酚、和厚朴酚之间的氢键结合，从而对厚朴酚、和厚朴酚的提取产生了不利影响。并且在含水率为40%和50%时，在相同时间下，提高温度对厚朴酚的提取率有显著促进作用，而对和厚朴酚的提取率影响较小。

2.4 DES组成摩尔比对木脂素提取率的影响

综合分析固液比与含水率的影响可知，提取条件为90 ℃、1.5 h时，黄酮的总提取率比较高，因此，选择此条件作为固液比优化的反应条件。在提取条件为微波功率160 W、含水率30%基础上，分析摩尔比为1∶2、1∶3、1∶4对木脂素类化合物提取率的影响。结果表明，随着摩尔比的增加，厚朴酚、和厚朴酚的提取率呈现先降低后略微增加的趋势（图4），可能是因为DES体系中氢键受体比例的降低，造成目标化合物与溶剂之间氢键的形成受到限制，此外，乙酰丙酸比例的增加，使溶剂整体的极性增加，而厚朴酚、和厚朴酚两种化合物的极性较低，导致二者提取率反而下降。

综上所述，当氯化胆碱/乙酰丙酸摩尔比1∶2、含水率30%、固液比1∶25 g/mL、提取温度90 ℃、提取时间1.5 h时，和厚朴酚、厚朴酚的提取率最高，分别为9.93、22.95 mg/g，总提取率为32.87 mg/g。采用中国药典甲醇法提取厚朴渣，在相同条件下得到总木脂素提取率为6.64 mg/g，使用DES的总提取率相比中国药典甲醇法提高了395.03%。

图2 不同固液比的ChCl-La对木脂素类化合物的提取率Fig.2 Lignanoids extraction rates by ChCl-La with different solid-liquid ratios

图3 不同含水率的ChCl-La在对木脂素类化合物的提取率Figure 3 Extraction rate of lignanoids by the solvents with different water contents

图4 不同组成摩尔比的ChCl-La对木脂素类化合物的提取率Fig.4 Lignanoids extraction rates by ChCl-La with different molar ratios

2.5 DES形成及萃取木脂素类化合物的机理分析

基于密度泛函理论的自洽场分子轨道法在M06-2X/6-311G**基组水平上对和厚朴酚、厚朴酚和本文选用的DES（ChCl-La）以及相应低共熔溶剂-木脂素类化合物体系进行几何构型优化，得到其最稳定构型。为了直观刻画木脂素类化合物与低共熔溶剂分子结构之间的相互作用，本文对优化的复合体系进行Kohn-Shame波函数计算，并基于约化密度梯度（RDG）方法对复合体系的分子间相互作用进行可视化分析。

和厚朴酚、厚朴酚与ChCl-La的 RDG 等值面和填色分析结果如图5所示。由图5可知，和厚朴酚、厚朴酚的喹啉环中存在明显的红色棱形区域，说明六元环中较强的位阻效应，与散点图中对应（+0.01，+0.05）之间的红色部分相吻合。绿色和墨绿色片状明显分布在和厚朴酚、厚朴酚与ChCl-La中间区域，以及ChCl-La之间，对应散点图中（-0.02，0.01）部分，证实了ChCl-La的Cl原子与厚朴酚、厚朴酚之间的弱相互作用主要表现为氢键作用力。此外，厚朴酚的两个氧甲基之间也存在少量蓝色片状分布，对应散点图中的（-0.05，-0.02）之间的蓝色部分，是厚朴酚分子内氢键相互作用的体现。因此，RDG 等值面和散点分析形象直观地说明和厚朴酚、厚朴酚与ChCl-La之间的作用力主要是弱相互作用，表现为范德华力和氢键作用。

物质的互溶度是由溶质和溶剂的分子间相互作用力来决定的，溶剂对溶质的溶解在于溶质－溶剂间的相互作用能够抵消溶质－溶质、溶剂－溶剂间的相互作用，即溶解过程自由能变小于0。为了考察DES对木脂素类化合物的萃取能力，利用高斯软件计算ChCl-La与厚朴酚、和厚朴酚的结合能。计算结果表明，ChCl-La与厚朴酚的分子间相互作用结合能为-81.386 kJ/mol，即ChCl-La和厚朴酚的相互作用为放热过程，二者的结合在能量上是有利的；ChCl-La与和厚朴酚的分子间相互作用结合能为280.297 kJ/mol，即ChCl-La和厚朴酚的相互作用为吸热过程，二者的结合在能量上是不利的。由此可见，ChCl-La与厚朴酚分子之间结合更加紧密，故ChCl-La对厚朴酚萃取能力大于和厚朴酚。

图5 ChCl-La-木脂素类化合物相互作用的填色图Fig.5 Color-filled maps of intermolecular interactions between ChCl-La and lignanoids

3 结 论

1）合成了10种绿色、环保、成本低的低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents，DES）用于提取厚朴渣中和厚朴酚、厚朴酚两种木脂素类化合物，其中，氯化胆碱/乙酰丙酸（ChCl-La）提取效率最高。考察了ChCl-La的DES组成摩尔比、含水率、固液比、提取温度和时间等因素对两种木脂素类化合物提取率的影响，提取工艺参数：摩尔比1∶2、固液比为1∶25 g/mL、溶剂含水率为30%、提取温度90 ℃、提取时间1.5 h，和厚朴酚、厚朴酚的提取率最高分别为 9.93、22.95 mg/g，总提取率为32.87 mg/g。

2）对ChCl-La与木脂素类化合物的量子化学分析表明，DES形成过程相互作用力以氢键作用为主，以范德华力为辅，无共价键、离子键等化学键形成。DES对厚朴酚提取过程，氢键作用发挥主要作用；DES提取和厚朴酚过程，以范德华力等弱作用力为主，无氢键形成。综上可见，低共熔溶剂与提取物之间氢键强度显著影响提取效果的差异，通过现代密度泛函理论的分子模拟计算低共熔溶剂与提取功效成分的相互作用，可指导快速筛选优良溶剂。