细胞周期蛋白依赖性激酶12抑制剂研究进展

刘萧悦，余子恒，王信人，唐伟方，陆涛

（中国药科大学理学院，江苏 南京 211198）

细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可通过磷酸化作用调节细胞周期进程以及基因转录。CDK在与调节亚基即周期蛋白（cyclin）结合形成异二聚体后才具有催化活性。目前，细胞周期蛋白依赖性激酶主要分为两类：一类是细胞周期相关激酶，主要调控细胞周期的各个阶段，包括CDK1、CDK2、CDK3、CDK4和CDK6；另一类是转 录相关激酶，主要调控基因转录进程，包括CDK7、CDK8、CDK9、CDK11、CDK12和CDK13[1]。

CDK12属于转录相关激酶，通过磷酸化RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，RNAP Ⅱ）的C端结构域（C-terminal domain，CTD）来调节基因转录[2]。CDK12在DNA损伤修复（DNA damage repair，DDR）、细胞生长和分化、前体mRNA剪接、内含子聚腺苷酸化、维持基因组稳定等多种细胞生命活动中发挥重要作用[2-3]。在多种肿瘤细胞中均存在CDK12基因的突变、扩增、缺失以及融合，其中基因扩增是最为常见的[4]。因此，作为治疗肿瘤的新兴靶点，CDK12已引起广大研究者的兴趣。本文对CDK12的结构功能和CDK12抑制剂的研究进展进行综述，以期为CDK12抑制剂的开发和应用提供思路。

1 细胞周期蛋白依赖性激酶12的结构

CDK12是从HeLa细胞的cDNA中发现的，最初被命名为Cdc2-related kinase（CrkRS）。编码CDK12的基因位于人17号常染色体长臂1区2带。CDK12由1 490个氨基酸组成，相对分子质量为164 000[5]。CDK12包含2个富含脯氨酸的基序（proline-rich motif，PRM），1个C端激酶结构域（carboxy-terminal kinase domain，KD）和1个精氨酸/丝氨酸结构域（arginine/serine domain，RS）（见图1）。PRM基序对蛋白质间的相互作用至关重要，RS结构域在前体 mRNA 的剪接中发挥重要作用。KD 结构域含有双叶折叠，包括一个高度疏水的N端叶（β1-β5）和包含α螺旋束的C端叶[6]（见图2）。CDK12主要与cyclin K结合形成二聚体发挥激酶活性。

CDK中，CDK13与CDK12高度同源，二者KD结构域相似程度达92%，但它们的C端和N端存在差异。CDK13的C端还包含1个富丝氨酸结构域（Ser-rich domain，SR）；N端包含2个富丙氨酸结构域（Ala-rich domains，AR）[2]（见图1）。CDK13基因可编码1 512个氨基酸。Cyclin K也是CDK13主要结合的细胞周期蛋白，CDK12与CDK13协同调控RNAP Ⅱ CTD磷酸化。目前，对CDK13的研究尚浅，其参与磷酸化RNAP Ⅱ的机制尚未明确，具体的生物学功能还有待进一步研究。

图 1 CDK12和CDK13的结构Figure 1 Structure of CDK12 and CDK13

图 2 CDK12-cyclin K-ADP共晶结构（PDB ID：4NST）Figure 2 X-ray co-crystal structure of CDK12-cyclin K-ADP (PDB ID: 4NST)

2 细胞周期蛋白依赖性激酶12的生物学功能

2.1 对基因转录的调控

RNAP Ⅱ是由RPB1、RPB4等12个亚基组成的蛋白质复合物。CTD结构位于RPB1羧基末端。在哺乳动物细胞中，CTD由7肽（Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7）重复序列组成[7]。CDK12通过磷酸化CTD的Ser2启动基因转录延伸。CDK12缺失主要影响维持基因组稳定性基因的表达。在果蝇细胞中，CDK12缺失影响氧化还原/抗氧化基因和控制代谢活性基因的表达[8]。在人体细胞中，CDK12缺失导致参与DDR过程的基因如BRCA、ATR、FANCI和FANCD2转录水平降低。此外，CDK12通过磷酸化RNAP Ⅱ CTD的Ser2招募裂解 刺 激 因 子77（cleavage stimulation factor 77，CsF77），使mRNA 3’末端多聚腺苷酸化，进而终止转录进程[5,9]（见图3）。

图 3 CDK12对RNA转录延伸、剪接及转录终止的调控作用Figure 3 Regulation of CDK12 on RNA transcription extension, splicing and transcription termination

2.2 参与RNA剪接

CDK12通过调控内含子的剪接，促进前体mRNA转变为成熟mRNA（见图2）。Rodrigues等[10]研究发现，在果蝇细胞中CDK12可通过调节CTD磷酸化调控Neurexin IV基因的剪接。在HEK293T细胞和HeLa细胞中的免疫共沉淀分析结果显示，CDK12可与部分剪接调控因子产生相互作用，如RNA结合基序蛋白（RNA-binding motif protein，RBM）和核内不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）[11]。据 报 道，CDK12的缺失会影响人类结直肠癌细胞中富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子1（serine and arginine rich splicing factor 1，SRSF1）的功能。目前，CDK12在前体mRNA剪接过程中的具体作用以及调控机制并未明确，有待进一步研究。

2.3 对细胞周期的调控

研究发现，CDK2-cylin E1复合物参与维持G1后期视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb）磷酸化，保证细胞由G1期进入S期。而CDK12-cyclin K复合物可诱导cyclin E1的Ser366磷酸化，阻止cyclin E1与CDK2形成复合物，进而导致G1/S期阻滞[12]。Chirackal Manavalan等[9]研究发现，抑制CDK12的表达将导致拓扑异构酶Ⅱβ结 合蛋白1（topoisomeraseⅡβ binding protein 1，TOPBP1）和细胞分裂周期蛋白6（cell division cycle protein 6，CDC6）的表达水平降低，引起细胞周期阻滞。Chen等[13]发现CDK12的缺失导致小鼠神经祖细胞在G2期和M期积累且有丝分裂细胞较正常细胞增加了1.3 ～ 4.6倍。近期一项研究表明，CDK12的缺失，可抑制有丝分裂调控激酶Aurora B的表达[14]。这些研究均表明CDK12在细胞周期进程中具有重要作用，但其具体调控机制还未明确。

2.4 对细胞生长分化的调控

在小鼠神经祖细胞中，CDK12的缺失导致幼鼠发育畸形并死亡[15]。CDK12和cyclin K对于胚胎干细胞的更新具有重要作用，它们的敲除将导致胚胎干细胞分化。研究发现，分化程度较低的细胞如小鼠胚胎干细胞，CDK12表达水平较高；而在分化程度较高的细胞中，CDK12表达水平明显下降，表明CDK12对细胞的分化具有重要作用。

2.5 对DNA损伤修复的调控

CDK12/cyclin K复合物通过调控RNAP ⅡCTD磷酸化来调节相关DDR基因的表达。CDK12/cyclin K的缺失主要抑制BRCA、ATR、FANCI和FANCD2等具有大量外显子的长基因的转录[5]。同时，抑制BRCA1基因表达将提高细胞对DNA损伤剂的敏感性。CDK12激酶结构域突变将导致同源重组（homologous recombination，HR）障碍，引起DNA双链断裂损伤，抑制DNA损伤修复[16]。

3 CDK12与肿瘤发生发展的关系

3.1 乳腺癌

人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性乳腺癌患者在乳腺癌患者中约占20%。在HER2基因扩增型乳腺癌患者中，常存在CDK12与HER2基因共扩增现象[17]。毛细血管扩张性共济失调蛋白（ataxiatelangiectasia mutated proteins，ATM）参 与 调 控DNA损伤修复和mRNA剪接过程。CDK12可调节ATM以及DNAJB6-L的最后外显子（alternative last exon，ALE）的剪接，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[18]。Choi等[19]指出，CDK12通过磷酸化RNAP Ⅱ激活WNT和IRS1-ErbB-PI3K等致癌通路，维持乳腺癌肿瘤干细胞的自我更新，驱动乳腺癌的发生发展。研究发现，抑制CDK12有助于提高曲妥珠单抗对HER2阳性肿瘤的抗癌效果。三阴性乳腺癌（triple negative brest cancer，TNBC）中存在DNA损伤修复相关基因的突变，包括p53、BRCA1、BRCA2基因等，使用CDK12抑制剂可以抑制TNBC细胞增殖以及增强肿瘤细胞对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制剂的敏感性[20]。

3.2 前列腺癌

对原发性前列腺癌（PCa）和转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）的基因组分析发现，CDK12突变在PCa中约占2% ～ 4%，在mCRPC中约占4% ～ 11%[21]。与其他肿瘤细胞中CDK12突变表现出的同源重组修复缺陷不同，mCRPC患者中CDK12突变表现为串联重复表型，其特点为基因融合增加、新抗原开放阅读框和高免疫浸润等[22-23]。Wu等[24]鉴定出了一种以CDK12双等位基因失活突变为特征的新型前列腺癌亚型，临床表现出高侵袭性特征，具有较高的高格里森评分。研究表明，CDK12的突变与前列腺癌的恶性程度相关，对CDK12的深入研究有望为前列腺癌的治疗提供新的方向。

3.3 胃癌

MAPK信号通路是癌变过程中典型的信号转导途径。CDK12通过磷酸化P21蛋白激活激酶2（p21 protein activated kinase 2，PAK2）中 的Thr134和Thr169，激活MAPK信号通路，促进胃癌的发生发展[25]。研究发现，在HER2阳性胃癌中存在CDK12扩增现象[26-27]。Ji等[28]在胃肿瘤细胞中检测到CDK12 表达水平较高，此外CDK12高表达患者的总生存率低于CDK12低表达患者。这些研究表明CDK12在胃癌的发生发展中具有重要作用。

3.4 尤文肉瘤

EWS/FL1是尤文肉瘤（Ewing’s sarcoma，ES）中最常见的染色体重排基因，EWS/FLI 融合蛋白可调控致癌基因的表达，已成为尤文肉瘤的分子诊断标志物。CDK12在尤文肉瘤中通常不发生突变，但抑制CDK12的表达在EWS/FLI阳性的尤文肉瘤中具有合成致死性。用THZ531处理ES细胞会抑制DDR基因的表达，提升细胞对 PARP 抑制剂的敏感性[29]。CDK12和PARP抑制剂的联合使用在 ES 细胞的异种移植小鼠模型中表现出强烈的协同作用[29]。CDK12抑制剂为尤文肉瘤的治疗提供了一种新的策略。

4 细胞周期蛋白依赖性激酶12抑制剂研究现状

由于CDK12在肿瘤发生发展中具有重要作用，抑制CDK12的表达将为多种肿瘤的治疗提供新的方法。尽管CDK12的作用机制未完全明确，但由于其在肿瘤治疗中具有极大潜力，CDK12抑制剂的开发已成为当下研究的热点，目前文献已报道了多种CDK12抑制剂，以下综述了目前具有代表性的CDK12抑制剂的研究进展。

4.1 THZ531

2014年，Kwiatkowski等[30]从激酶抑制剂库中筛选出CDK7抑制剂THZ1（1）。THZ1中的丙烯酰胺亲电弹头可与CDK7的C端延伸中的Cys312形成不可逆共价键。Zhang等[31]根据CDK12-cyclin K的共晶结构发现，CDK12的Cys1039和CDK7的Cys312具有相似的空间位置。Zhang等用苯基（1-哌啶基）甲酮取代THZ1中的N-苯基苯甲酰胺，得到了化合物THZ531（2）。共晶结构表明，THZ531中2-氨基嘧啶可与CDK12激酶铰链区的Met816形成2个氢键[31]（见图4）。THZ531几乎消除了对CDK7的激酶抑制活性，IC50值是8.5 μmol · L-1，而对CDK12与CDK13的选择性大大提高，IC50值分别为0.158和0.069 μmol · L-1。在尤文肉瘤细胞中，THZ531抑制DNA修复相关基因的表达，并增强细胞对奥拉帕尼的敏感性。最新研究表明，THZ531作为ABC蛋白转运体的底物介导细胞耐药性的产生，还需进一步探索适合临床应用的小分子抑制剂。

图 4 THZ531与CDK12的对接图 （PDB ID：5ACB）Figure 4 Molecular docking model of THZ531 with CDK12 (PDB ID: 5ACB)

4.2 SR-4835

基于THZ531较好的激酶选择抑制活性，Quereda等[32]从THZ531类似物激酶抑制剂库中筛选得到了化合物SR-4835（3）。SR-4835和CDK12的共晶结构表明，SR-4835通过C6-N7、嘌呤环N7和苯并咪唑环与CDK12激酶结构域的Tyr815、Met816和Asp819形成氢键[32]（见图5）。该化合物对CDK12与CDK13具有高选择性，对CDK12的IC50值为99 nmol · L-1，Kd值为98 nmol · L-1。SR-4835对TNBC细胞具有较强的抑制作用，EC50值为20 ～ 40 nmol · L-1[32]。在患者来源的TNBC异种移植小鼠中进行的研究发现，SR-4835可显著抑制肿瘤生长，联合PARP抑制剂治疗可使肿瘤快速消退。单独使用SR-4835未引起小鼠体质量下降，对小鼠无明显毒性。SR-4835作为一个具有良好活性的抑制剂，有望成为治疗TNBC的候选药物。

图 5 SR-4835与CDK12的对接图（PDB ID：6B3E）Figure 5 Molecular docking model of SR-4835 with CDK12 (PDB ID: 6B3E)

4.3 MFH290

2004年，Misra等[33]报 道 了CDK2抑 制剂SNS032（4），研究发现SNS032的哌啶环可与CDK12的Cys1039共价结合。Liu等[34]结合THZ531的结构特征，对SNS032进行结构改造，得到了带有丙烯酰胺基团的化合物5，其对CDK7的抑制作用降低（IC50= 0.457 μmol · L-1），进一步引入3-氨基哌啶结构得到化合物MFH290（6）。MFH290可与CDK12的Cys1039进行共价结合[34]（见图6）。MFH290对CDK12具有较高的选择性（IC50= 0.025 μmol · L-1）。MFH290在小鼠体内药代动力学测定结果显示，静脉注射给药时其半衰期较短，清除率较高（T1/2= 0.17 h，CL = 102.03 mL·min-1· kg-1），还需要进一步结构优化以提高体内代谢稳定性。

图 6 MFH290与CDK12的对接图（PDB ID：5ACB）Figure 6 Molecular docking model of MFH290 with CDK12 (PDB ID: 5ACB)

4.4 BSJ-4-116

Jiang等[35]以THZ531中的结构片段作为优势配体，选择cereblon（CRBN）作为E3泛素连接酶，设计合成了一系列降解分子，其中BSJ-4-23（7）对CDK12具有显著降解作用。研究发现，BSJ-4-23可与CRBN/CDK12形成稳定的三元复合物，而无法与CDK13形成稳定的复合物，从而实现了对CDK12的选择性。(R)-3-氨基哌啶是诱导CDK12发生降解的特殊位置，进一步优化得到降解剂BSJ-4-116（8）。共晶结构表明，BSJ-4-116中氨基嘧啶部分可与CDK12激酶铰链区的Met816形成2个氢键[35]（见图7），其对CDK12的抑制活性有所提高（IC50为6 nmol · L-1）。在Jurkat细胞中，BSJ-4-116可诱导CDK12降解，CDK13水平未有明显变化。此外，BSJ-4-116可克服CDK12的C1039F突变产生的获得性耐药性。BSJ-4-116作为第一个选择性CDK12降解剂，为CDK12作用机制的研究以及后续抑制剂的开发提供了方向，但是长期暴露于该药可导致CDK12突变产生获得性降解抗性。因此，CDK12降解剂的开发有待进一步的研究。

图 7 BSJ-4-116与CDK12的对接图（PDB ID：5ACB）Figure 7 Molecular docking model of BSJ-4-116 with CDK12 (PDB ID: 5ACB)

4.5 Dinaciclib

Dinaciclib（MK-7965，SCH727965，9）是由德国默克（Merck）公司研发的多靶点的CDK1/2/5/9抑制剂。Paruch等[36]以吡唑并嘧啶为结构基础，对化合物10进行优化得到了化合物11，该化合物对CDK2具有较好的抑制活性。对吡唑并嘧啶环进行一系列结构改造最终得到化合物dinaciclib，该化合物可与CDK12的Met816形成关键性氢键[37]（见图8）。Dinaciclib对CDK1、CDK2、CDK5和CDK9的IC50分别为3、1、1和4 nmol · L-1[38]。Dinaciclib联合帕比司他用药可诱导MLL-AF9肿瘤细胞凋亡，使小鼠中位生存期从33 d增加到52 d。研究发现，dinaciclib对CDK12也具有一定抑制活性，IC50为50 nmol · L-1。在BRCA突变且对PARP抑制剂耐药的TNBC患者中，dinaciclib可抑制肿瘤DNA修复，同时增强肿瘤对PARP抑制剂的敏感性。尽管dinaciclib抑制活性较高，但缺乏CDK12选择性，进一步开发具有选择性的CDK12抑制剂具有重要意义。

图 8 Dinaciclib与CDK12的对接图（PDB ID：4NST）Figure 8 Molecular docking model of dinaciclib with CDK12 (PDB ID: 4NST)

4.6 CDK12-IN-3

CDK12-IN-3（12）是由阿斯利康团队研发的一种选择性的CDK12抑制剂。CDK12-IN-3是基于dinaciclib和SR-3029（13）的结构设计的。Dinaciclib是一种高效非特异性的CDK1/2/5/9/12抑制剂。SR-3029在低ATP水平下对CDK12具有中度抑制活性，对CDK1/2/7/9的抑制活性较差[39]。研究发现，SR-3029中嘌呤核心和二氟联苯咪唑结构对CDK12的选择性具有重要作用；dinaciclib中(S)-3-(哌啶-2-烷基)取代邻苯丙醇结构是活性提升的关键。基于此，阿斯利康团队采用优势片段相拼合的设计策略，首先设计得到化合物14，该化合物对CDK12具有较好的选择性，但是其抑制活性大大降低。对嘌呤核心进一步结构优化得到化合物15，该化合物对CDK12和CDK2同时具有较高的抑制活性。采用异丙基替代化合物15中嘌呤结构N-9上的乙基，得到化合物CDK12-IN-3。共晶结构显示，该化合物可与CDK12中Tyr815、Met816和Asp819形成氢键[40]（见图9）。CDK12-IN-3在高ATP水平下对CDK12表现出了较高的选择抑制活性，IC50值为491 nmol · L-1[40]。研究发现，CDK12-IN-3可抑制RNAPⅡCTD的Ser2磷酸化，对卵巢癌OV90细胞株的生长有抑制作用。

图 9 CDK12-IN-3与CDK12的对接图（PDB ID：6B3E）Figure 9 Molecular docking model of CDK12-IN-3 with CDK12 (PDB ID: 6B3E)

4.7 E9

Nathanael等[41]以dinaciclib和THZ531为基础，设计得到了专利化合物16，相比于dinaciclib，该化合物对CDK9的选择性有所提高，进一步优化得到专利化合物E9（17），其与THZ系列和dinaciclib相比，选择性均有一定的提高。共晶结构表明，E9中丙烯酰胺结构可与CDK12的Cys1039共价结合[42]（见图10）。研究发现，E9克服了THZ系列化合物作为ABC转运体底物易产生耐药性的缺陷[42]。E9在低浓度范围内与生物素化的THZ1强烈竞争与CDK12的结合。在THZ1耐药的人NB细胞（THZ1RNB）和肺癌模型中，E9表现出较强的抗增殖活性，IC50为8 ～ 40 nmol · L-1。E9避免了ABC蛋白转运体介导的药物外排，有望成为靶向CDK12的候选药物。

图10 E9与CDK12的对接图（PDB ID：6B3E）Figure 10 Molecular docking model of E9 with CDK12(PDB ID: 6B3E)

5 结语

CDK12调控转录延伸，参与DDR、DNA复制和RNA剪接等过程，在肿瘤的发生发展中具有重要作用。目前CDK12抑制剂尚处于临床前研究阶段。由于CDK12和CDK13结构高度相似，现有的CDK12抑制剂多为CDK12/13双重抑制剂，缺乏CDK12特异性。随着对CDK12和CDK13结构的深入研究，计算机模拟等手段将会为CDK12抑制剂的筛选开发提供新的方向。部分CDK12抑制剂由于较差的药代动力学性质而限制了临床应用。因此，开发具有良好成药性的选择性CDK12抑制剂不仅有助于深入研究CDK12的生物调控机制，还可为肿瘤的治疗提供新策略。