血清神经肽吻素水平在卵巢储备功能减退不孕症患者中的变化及其诊断价值

王金玉，陈圆辉，王倩，张啸龙，张杰平，范英英，张翠莲

(郑州大学人民医院，河南省人民医院，郑州 450003)

卵母细胞数量减少、质量降低，导致生殖能力下降，最终表现为生殖能力丧失或绝经，称为卵巢储备功能减退(DOR)。大约10%的不孕妇女患有DOR[1]，随着经济发展、女性生育年龄延迟等因素，利用辅助生殖技术(ART)助孕的DOR患者逐年增多，并且呈年轻化趋势。因此，对于<35岁的年轻不孕女性，及早诊断DOR将有利于预测卵巢低反应，以期制定个体化治疗措施达到尽早生育的目的。神经肽吻素(Kisspeptin)是调节女性生殖内分泌的关键神经肽，主要通过在上游调节下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)分泌，进而调控下丘脑-垂体-性腺轴。研究表明，很多生殖内分泌疾病，如卵巢早衰(POF)、低促性腺激素性性腺功能减退症、多囊卵巢综合征、病理性高泌乳素血症等，都与Kisspeptin的异常表达有关[2]。但是，Kisspeptin作为重要的生殖激素，其与DOR发病相关性的研究鲜有报道。因此，本研究拟采用酶联免疫吸附(ELISA)试验法检测DOR患者血清基础Kisspeptin(bKisspeptin)水平，并绘制受试者特征工作曲线(ROC)以探讨其对DOR的诊断价值，以期为早期诊断DOR并制定合理的治疗方案提供依据。

资料与方法

一、研究对象

收集2020年7月至2021年1月于我院生殖医学中心首次经ART助孕的不孕症患者的临床资料，根据卵巢储备功能检查结果分为DOR不孕症组(DOR组)和卵巢功能正常的不孕症组(对照组)。

纳入标准：(1)对照组患者要求均有排卵，月经周期正常，基础性激素水平正常，月经第3天窦卵泡计数(AFC)7～20个，仅因输卵管因素或男方因素导致不孕；(2)DOR组患者要求符合DOR诊断标准[3-4]：月经第3天(月经紊乱者可于超声检查未见优势卵泡时)AFC<7个、抗苗勒管激素(AMH)≤1.1 ng/ml、基础卵泡刺激素(bFSH)≥10 U/L，3项中符合2项并排除输卵管因素或男方因素导致不孕的患者。

排除标准：(1)存在染色体异常；(2)存在其他影响Kisspeptin水平的相关疾病，如子宫内膜异位症、子宫腺肌症、多囊卵巢综合征、低促性腺激素性性腺功能减退症、高泌乳素血症等；(3)近3个月内应用激素类药物治疗者；(4)糖尿病、甲状腺功能亢进症等内分泌代谢疾病患者。

共纳入145例患者，其中DOR组80例，对照组65例。

本研究通过河南省人民医院伦理委员会审核并批准。

二、研究方法

1.样本收集：于月经周期第3天(月经紊乱者可于超声检查未见优势卵泡时)，清晨空腹采集外周静脉血 5 ml，于室温静置30 min，以3 000 r/min离心10 min，吸取上清，置于-80℃冰箱内保存备用。

2.基础激素水平检测：血清bKisspeptin水平检测采用ELISA试剂盒(上海蓝基生物)，并按照说明书进行操作。将试剂和样本缓慢恢复至室温，酶标板中加入100 μl/孔待测样本，在各孔中加入50 μl的酶标记溶液(不含空白对照孔)，37℃孵育反应1 h后充分清洗酶标板3～5次；用吸水纸彻底拍干酶标板后各孔加入显色剂A、B各50 μl，20～25℃下避光反应10 min，各孔滴加50 μl终止液，立即用酶标仪(BioTek，美国)测量各孔450 nm的光密度值(OD)，并以PBS为空白对照，绘制标准曲线并计算待测样本含量。血清AMH、bFSH、基础黄体生成素(bLH)、基础雌二醇(bE2)等性激素水平采用电化学发光仪(Elecsys e602，罗氏，瑞士)检测。

三、统计学方法

采用 SPSS 21.0 软件进行数据的统计分析。计量资料不符合正态分布，以中位数(四分位间距)[M(P25，P75)]表示，组间比较采用非参数检验；相关因素的分析采用Spearman相关性分析法；应用ROC曲线分析血清bKisspeptin的诊断效能。以P<0.05为有统计学意义。

结 果

一、患者一般资料比较

两组间年龄和体质量指数(BMI)比较均无显著差异(P>0.05)；DOR组血清bKisspeptin、bFSH、bLH水平均显著高于对照组，而血清AMH、AFC、bE2水平均显著低于对照组(P<0.05)(表1)。

表1 两组患者的一般资料比较[M(P25，P75)]

二、血清bKisspeptin水平与卵巢储备功能指标的相关性分析

Spearman相关性分析结果显示，DOR患者血清bKisspeptin与bFSH、bLH水平呈显著正相关关系(P<0.05)，与AMH、AFC呈显著负相关关系(P<0.05)，与年龄、BMI、血清bE2水平无显著相关关系(P>0.05)(表2)。

表2 DOR患者血清bKisspeptin与卵巢储备功能指标的相关性

三、血清bKisspeptin及卵巢储备功能指标对DOR的诊断效能

ROC曲线分析显示，血清bKisspeptin诊断DOR的曲线下面积(AUC)为0.87，截断值为418.42 pg/ml，敏感性68.75%，特异性89.23%；血清AMH诊断DOR的AUC为0.97，截断值为1.17 ng/ml，敏感性87.50%，特异性95.38%；AFC诊断DOR的AUC为0.96，截断值为7.00个，敏感性95.00%，特异性84.62%；血清bFSH诊断DOR的AUC为0.95，截断值为7.24 U/L，敏感性93.75%，特异性89.23%，且均有统计学意义(P<0.05)(表3，图1)。

表3 血清bKisspeptin及卵巢储备功能指标对DOR的诊断效能

图1 血清bKisspeptin及各卵巢储备功能指标对DOR的诊断效能分析

四、不同年龄组中血清bKisspeptin水平对DOR的诊断效能分析

众所周知，年龄是影响卵母细胞数量及质量的首要因素，也是卵巢反应性的独立预测因子[5]。因此，本研究进一步根据患者年龄分为两个亚组，即<35岁低龄组和≥35岁高龄组。

ROC曲线对比分析显示，低龄组血清bKisspeptin诊断DOR的AUC为0.93，显著大于高龄组的0.84和未年龄分组的0.87(P<0.05)；低龄组血清bKisspeptin鉴别DOR的截断值为400.68 pg/ml，显示敏感性73.53%、特异性96.55%(P<0.05)；高龄组血清bKisspeptin鉴别DOR的截断值为316.92 pg/ml，显示敏感性93.48%、特异性61.11%(P<0.05)(表4，图2)。

表4 不同年龄患者血清bKisspeptin对DOR的诊断效能

A：低龄组；B：高龄组图2 各年龄组血清bKisspeptin对DOR的诊断效能分析

讨 论

DOR也称卵巢储备功能低下，以生育力下降、卵巢储备功能指标变化、排卵障碍、月经不调、不孕为病理特征。近年来DOR患者越来越多，且呈年轻化趋势，寻求ART治疗的<35岁的年轻DOR不孕患者也逐渐增加，及早诊断DOR，将有利于预测卵巢低反应、制定个体化治疗措施，达到尽早生育的目的[6]。另外，严重DOR患者的卵巢生殖功能会逐渐下降，发展为早发性卵巢功能不全(POI)，甚至发展为POF，导致女性生育力丧失或绝经。研究发现，DOR是连续的过程，其病程可分为4个阶段：(1)基础促性腺激素正常，但促排卵出现卵巢低反应为隐匿期；(2)基础促性腺激素水平升高，促排卵出现卵巢低反应为生化期；(3)基础促性腺激素显著上升、生育能力显著下降，并且出现月经不调，甚至伴随因雌激素缺乏所致的一系列症状为显性期；(4)原始卵泡处于不可逆的耗竭状态的为POF期[7-8]。为了及早发现、早期干预卵巢功能减退的患者，欧洲人类生殖及胚胎学会在2016年发表指南[9]，将POF诊断前移，提出“POI”概念，并将bFSH的诊断阈值由40 U/L下调到25 U/L。我国2017年于《中华妇产科杂志》发表的专家共识提出“亚临床期POI”概念，将bFSH诊断阈值下调为15～25 U/L[10]。实际上，bFSH的波动范围非常大，即使是POI的患者，bFSH也有可能在正常范围内，但当bFSH高达25 U/L时，使用ART治疗的成功率己经很低。因此本研究纳入DOR患者以bFSH≥10 U/L为诊断阈值，以期发现新的早期DOR诊断指标，以利于患者及时进行ART或生育力保存治疗，并通过尽早干预，减缓其DOR的进程。

Kisspeptin是调节女性生殖内分泌关键信号因子，主要在GnRH神经元的上游起作用。下丘脑内Kisspeptin神经元位于下丘脑的弓状核(ARC)和前腹侧室周核(AVPV)。研究发现，ARC的Kisspeptin神经元主要接受E2的负反馈，AVPV的Kisspeptin神经元主要接受E2的正反馈。并且，ARC的Kisspeptin神经元不仅表达Kisspeptin，还共表达神经激肽B(NKB)和强啡肽(Dyn)，因此也被称作Kisspeptin/神经激肽B/强啡肽(KNDy)神经元[11]。AVPV的Kisspeptin神经元和ARC的KNDy神经元共同调控GnRH的分泌，从而调控生殖轴[11]。目前，越来越多研究发现，生殖内分泌疾病与Kisspeptin异常表达有关，如低促性腺激素性性腺功能减退症、多囊卵巢综合征、病理性高泌乳素血症等。翟君钰[8]发现，POI和POF不孕女性的血清bKisspeptin显著高于正常对照组。师红美等[12]利用6周龄雌性balb/c小鼠建立POF模型，免疫组化结果显示，POF小鼠卵巢次级卵泡中表达Kisspeptin的阳性细胞数比对照组显著减少，提示Kisspeptin信号通路可能参与POF的发病机制。然而，张艳婷[13]研究发现，月经第2～3天DOR患者血清bKisspeptin水平与对照组比较无显著差异，但该研究纳入的样本量较小，且部分患者基础血清采集时期为口服避孕药、孕激素撤退性出血的第2～3天，因此，无法排除激素类药物对bKisspeptin水平的影响。另外，Zhai等[14]对正常育龄女性血清Kisspeptin在月经周期中的变化情况进行了监测，发现月经第3天血清Kisspeptin较低，而在月经期第11天时优势卵泡生长约达1.2 cm时出现血清Kisspeptin峰值。最近，Abbara等[15]皮下注射Kisspeptin-54对女性患者进行促排卵治疗，结果发现注射后卵母细胞成熟率增加，注射Kisspeptin-54的12 h内LH和孕酮水平激增，更进一步显示了Kisspeptin参与促进卵泡发育成熟及诱导排卵。

鉴于DOR不孕女性的血清bKisspeptin水平鲜有研究，以及血清Kisspeptin水平与卵泡生长发育有一定关联，本研究选择在月经第3天(月经紊乱者可于超声检查未见优势卵泡时)采集DOR患者血清测定bKisspeptin水平。本研究结果显示，DOR组血清bKisspeptin水平与bFSH、bLH水平呈显著正相关(P<0.05)，说明下丘脑分泌的Kisspeptin作为GnRH的上游调节因子参与调控bFSH和bLH的分泌。另外，本研究结果显示，DOR患者血清bKisspeptin与AMH、AFC呈显著负相关(P<0.05)，说明血清bKisspeptin可能与DOR密切相关。与对照组比较，DOR患者血清AMH、AFC、bE2水平显著降低，而血清bKisspeptin、bFSH水平则显著升高(P<0.05)，推测其可能作用于卵泡起始阶段，由于DOR患者AFC数减少，其血清bE2水平降低，从而使得bE2的负反馈信号传递给ARC的KNDy神经元，KNDy神经元被激活后引起Kisspeptin、NKB、Dyn分泌增加，而此时Dyn诱发低频率的GnRH脉冲导致血清bFSH分泌增加，刺激卵泡的募集和生长。关于血清bKisspeptin对DOR的诊断价值，本研究结果表示，未进行年龄分组时，血清bKisspeptin诊断DOR的AUC为0.87，显著低于AMH、AFC、bFSH诊断DOR的AUC(P<0.05)。众所周知，年龄是影响卵母细胞数量及质量的首要因素，也是卵巢反应性的独立预测因子[5]。因此，本研究进一步根据年龄分组发现，<35岁患者的血清bKisspeptin诊断DOR的ROC-AUC为0.93，敏感度73.53%，特异度96.55%，提示血清bKisspeptin是一个较为理想的诊断标志物，尤其是对于<35岁的年轻DOR患者诊断效能更高。

由于本研究属于单中心、小样本研究，结论可能存在一定的偏倚，后期尚需要更多高质量、多中心、大规模的研究加以探讨证实。

综上所述，血清bKisspeptin水平检测能够为DOR患者的早期诊断提供理论依据，尤其对<35岁的年轻DOR不孕女性的诊断价值较高。DOR过程是不可逆的，与≥35岁患者相比，<35岁DOR患者行ART仍然可以获得较好的临床妊娠结局[16]。临床上若发现患者不孕或月经紊乱，但是基础促性腺激素尚未出现异常或异常程度较轻微，可通过检测血清bKisspeptin水平协助预测其卵巢功能是否减退，为卵巢功能预测提供新的检测指标。