一株重组犬冠状病毒的鉴定及3′端分子特征分析

蔡冬冬，李建岗，范 毅，罗 毅，崔鹏博，胡晓亮，田志革*

（1.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；2.四川省成都市动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；3.宜宾学院农林与食品工程学部，动物多样性与生态保育宜宾市重点实验室，四川 宜宾 644000；4.成都海关，四川 成都 610041）

1 材料与方法

1.1 病料来源 一只35日龄博美犬患有严重的肠炎，临床症状表现为食欲减退，呕吐，发热，腹泻，利用胶体金试纸条检测粪便，结果为犬冠状病毒阳性，犬瘟热病毒阴性，犬细小病毒阴性和犬腺病毒阴性。

按照DNA/RNA 提取试剂盒说明书，提取病犬粪便的DNA/RNA，进一步加入M-MLV将RNA反转录成cDNA，备用。

1.2 主要试剂 病毒总RNA/DNA 提取试剂盒，胶回收试剂盒，反转录试剂盒，Ex Taq 酶、MLV、RRI。

1.3 引物设计 利用犬冠状病毒鉴定引物R-F：5′-CCTTAAGAACTAAACTTATGA-3′；R-R：5′-ATGCCGACACAAGTCTTAAAG-3′对粪便进行PCR鉴定，根据测序结果以HLJ-071 和CB/05 基因序列（登录号为KY063616.1 和KP981644.1）设计测序引物（表1）。

表1 引物信息

1.4 PCR 扩增及测序 PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共进行30 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物在10 g/L 琼脂糖凝胶中电泳，切胶并回收目的片段，由长春库美生物科技有限公司测序。将序列拼接后提交NCBI，命名为BM35，登录号为MT919267。

1.5 基因序列的比较分析和重组分析 利用DNAStar 软件对BM35 的3′端基因组序列进行同源性比较，用MEGA6.0 构建遗传进化树分析BM35 的3′端序列，分析比较BM35 与参考毒株的遗传进化关系，序列信息见表2。利用Simplot 软件进行BM35 的重组分析。

表2 CCoV毒株信息

2 结果

2.1 犬冠状病毒的鉴定 犬冠状病毒特异性引物PCR 扩增的片段大小为409 bp，与预期片段大小一致（见图1），测序结果经比对确定为犬冠状病毒，将该毒株命名为BM35。对5对测序引物进行特异性扩增、测序，拼接得到BM35 的3′端序列，片段长度为8 870 bp。

图1 犬冠状病毒的鉴定

2.2 基因序列的比较分析 BM35与参考序列之间的同源性最高的为B639/ZJ/2019（95.9%），与国内分离株HLJ-071 的同源性为91.5%，与经典CCoV IIa 分离株1-71 和K378 的同源性分别为90.8%和91.1%，与日本分离株FC1 的同源性为92.4%。

2.3 BM35 的遗传进化分析 使用MEGA6.0 软件将BM35 与国内外犬冠状病毒核酸序列进行比对，构建进化树。结果显示：基于3′端序列比对，BM35与浙江株B639/ZJ/2019、台湾株NTU336、日本株FC1 和越南株HCM47 处于同一分支，该分支独立成为一簇，区别于CCoV I型和II 型分支（见图2A）；基于S 基因建立的进化树显示BM35 与浙江株B639/ZJ/2019、台湾株NTU336、日本株FC1 和越南株HCM47 处于同一独立分支（见图2B）。

图2 3′端和S基因的遗传进化树

2.4 BM35的重组分析 由于BM35与台湾株和国外株的遗传关系密切，因此推测BM35 可能会发生重组。重组分析结果显示：BM35在S基因大约1 000 bp 处与台湾株NTU156 和越南株HCM47发生了重组。

3 讨论

3.1 CCoV 的流行病学 CCoV 是引起犬急性胃肠炎的重要病原，1971 年由德国首次报道后，相继在亚洲、南美洲、北美洲等多个国家和地区流行，给经济动物产业带来极大的危害。2005年以来，我国学者在黑龙江、江苏、辽宁、云南和吉林省进行了CCoV 流行病学调查，结果发现其血清阳性率为28.36%～87.2%，说明CCoV 在我国呈广泛性分布［1-2］。由于CCoV本身容易与自身及其他冠状病毒发生基因重组，而犬作为人类最主要的伴侣动物，与人有着最密切的接触，使得人们开始重新评估CCoV 对人类的潜在危害性，具有一定的公共卫生意义。

本研究从患病犬中鉴定出一株CCoV（BM35），遗传进化树分析显示其3′端和S基因序列与浙江株B639/ZJ/2019、台湾株NTU336、日本株FC1 和越南株HCM47的遗传关系较近，处于同一独立分支，而与CCoV IIa 型毒株1-71 和K378，CCoV IIb型毒株450/07，国内分离株HLJ-071 等毒株的遗传关系较远。

3.2 CCoV 的同源重组与进化 同源重组和点突变是冠状病毒遗传进化的主要动力之一［3-4］。尽管多数犬感染CCoV 后呈现肠道的病理变化，但近年来国外研究报道显示CCoV能够由仅引起肠道变化转变为全身组织产生明显病变，甚至导致犬死亡。BGF株能够产生明显的临床症状，基因组序列分析发现在M 蛋白的末端具有高度可变区［5］。2009 年，在引起犬急性肠炎的流行病学监测中分离到4株CCoV II型毒株，致病性分析发现其能够导致犬死亡，这4 株病毒的典型特征是在S 基因的N 端存在TGEV 重组的迹象［6］。2019年，陈思等［7］分离到一株CCoV HLJ-073，其S、E和M 基因与FCoV WSU79-1683 和CCoV 的A76发生过重组，并且HLJ-073 有ORF3abc 缺失，导致其能够在犬单核巨噬细胞和人巨噬细胞THP-1 中复制。2021 年，田志革等［8］分离到的一株CCoV HLJ-071，能够在犬单核巨噬细胞中复制，说明CCoV在国内经历了快速进化。

4 结论

本研究鉴定了一株CCoV（BM35），遗传分析发现其与多株国外毒株的遗传关系较近，并且与台湾株NTU156和越南株HCM47发生过重组，这有助于了解国内CCoV 的流行病学特征，为后续诊断试剂和疫苗的开发提供依据。