植酸酶体外降解米糠粕中植酸的工艺研究

杨 华 ， 梁丽萍 ， 陈雪娇 ， 张媛媛 ， 马金鹏 ， 权志中 ， 杨 宁 ， 宣 丽

（1.沈阳市现代农业研发服务中心＜沈阳市农业科学院＞，辽宁沈阳 110025；2.辽宁康普利德生物科技有限公司，辽宁铁岭 112600；3.辽宁省饲料预消化专业技术创新中心，辽宁铁岭 112600）

为适应大宗饲料原料供需趋紧的形势， 提升原料利用效率，立足国情构建新型日粮配方结构，加快推进玉米、豆粕减量替代，开发非常规性饲料资源已成为当前研究的热点。 米糠粕是大米加工的副产品，资源丰富，价格低廉，含有较高的营养成分，可以作为玉米豆粕减量替代的原料之一（曹康宁，2019）。但是由于米糠粕中非淀粉多糖（贾素巧等，2019）和植酸（张抒爱等，2021）等抗营养因子含量较高， 用量过高往往会影响饲粮整体养分消化， 导致畜禽生产性能下降 （韩萍萍等，2020；Sanchez 等，2019；孙伟武等，2017；叶永青和罗小溪，2017；钱利纯和尹兆正，2005），在应用时比例受到限制。

植酸是米糠粕中重要的抗营养因子， 比例高达 8%（马泽林，2017；Casas 和 Stein，2016）。 由于植酸化学性质比较稳定， 难以通过加热等物理处理方法破坏， 在动物体内也没有相应的酶系能消化降解。目前主要是通过在饲料中添加植酸酶，在动物体内对植酸进行降解， 而且得到了极广泛的应用 （Ranjan 等，2021；Neto 等 ，2021；Maas 等 ，2020； 纪婷婷等，2017； 周定勇，2015；Kumar 等，2012）。 然而，酶制剂在体内的作用效果只能通过饲养试验生产性能的表现来反向评估。 Rosenfelder-Kuon 等（2020a）研究表明，随着植酸酶的添加，虽然在猪的粪便中，植酸的回收率很低，但猪的平均磷消化率稳定在65%，并且在高水平添加植酸酶的情况下， 猪全肠道磷消化率也不超过60%。因此，有必要寻求获得更高磷消化率的处理技术（Rosenfelder-Kuon 等，2020b）。

饲料预消化技术是为了提高饲料原料的消化吸收率，在动物体外，根据不同原料的具体特性，模拟动物的消化过程， 进行的特定化处理的生物饲料加工技术。 酶解预消化是将原料、酶制剂、水混合，在一定的作用条件下，对目的物进行处理的一种饲料预消化手段，过程可控制，结果更明确，在原料预处理方面受到普遍关注。 本试验采用酶解的手段，用植酸酶体外酶解米糠粕，通过单因素和正交试验观察植酸的降解程度， 以期为后续的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂 供试材料：米糠粕由辽宁康普利德生物科技有限公司提供， 含粗蛋白质16.9%、 粗脂肪 1.38%、 粗灰分 11.9%、 总磷1.55%、粗纤维8.0%、中性洗涤纤维33.3%、酸性洗涤纤维10.4%、酸性洗涤木质素3.3%。 植酸酶1、植酸酶 2、植酸酶 3（活力均为 1.0×104U/g）来自辽宁省饲料预消化专业技术创新中心实验室。

供试试剂：浓盐酸、硫酸钠、磺基水杨酸、三氯化铁、氢氧化钠，分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；植酸钠标准品，纯度98%（北京谱析科技有限公司）。

1.2 主要仪器 UV-1700 型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；HJ-M6 型水循环磁力搅拌水浴锅 （金坛市城西春兰实验仪器厂）；STARTER 3100 型 pH 计、CP 214 型电子天平 （上海奥豪斯仪器有限公司）；SHA-B 型水浴恒温振荡器（金坛市精达仪器制造厂）；FW177 型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；SC-3614 型低速离心机 （安徽中科中佳科学仪器有限公司）；101FA-0型电热鼓风干燥箱 （上海树立仪器仪表有限公司）。

1.3 植酸的测定 称取1 g 米糠粕、酶解米糠粕样品，精确至0.0001 g，置于100 mL 具塞三角瓶中， 加入 40 mL 的 1.2% HCl·10% Na2SO4溶液，于室温下振荡 2 h，4000 r/min 离心 20 min， 上清液于4 ℃冰箱中备用待测（傅启高等，1997）。

标准曲线的制作： 精确吸取0.1 mg/mL 植酸标准溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 6 支 25 mL具塞试管中，用蒸馏水补足至5 mL，混匀后，加入4 mL 的 0.3%磺基水杨酸·0.03% FeCl36H2O 溶液，摇匀，放置15 min 后，于500 nm 处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，植酸含量为横坐标，绘制标准曲线并计算回归方程及相关系数。

取稀释到一定浓度的植酸提取液5 mL 于25 mL 具塞试管中，其余步骤同标准曲线的制作，测其吸光度， 并从回归方程计算出试液中植酸含量。

式中：m1为酶解前米糠粕中植酸的百分含量；m0为酶解后米糠粕中植酸的百分含量。

1.4 试验设计 能够准确测定米糠粕酶解pH的最低加水量为：料水比 1：3（g/mL），本试验固定酶解反应的料水比为1：3， 首先研究不同pH条件下3个植酸酶的酶解效果，在此基础上探究不同酶解温度、酶添加量、酶解时间对米糠粕中植酸的降解效果。 在单因素试验基础上，采用正交试验优化酶解条件，从而确定植酸酶体外酶解的工艺条件。

1.5 单因素试验

1.5.1 植酸酶在不同pH 条件对米糠粕中植酸降解率的影响 称取30.00 g 米糠粕若干份于250 mL烧杯中，加蒸馏水90 mL，用1 mol/L 的HCl 调pH为 3.9、4.3、4.7、5.1、5.5， 植酸酶 1、2、3添加量均为1.2%（酶质量/米糠粕质量），50 ℃酶解 2.0 h。 反应结束后，沸水浴灭酶，样品85 ℃烘干，粉碎后提取植酸，测定植酸含量并计算植酸降解率。

1.5.2 酶解温度对米糠粕中植酸降解率的影响料水比1：3，酶解 pH 4.7，植酸酶3 添加量 1.2%，酶解时间 2.0 h，酶解温度 40、45、50、55、60 ℃，其余操作同1.5.1。

1.5.3 酶添加量对米糠粕中植酸降解率的影响料水比 1：3，酶解 pH 4.7，酶解温度 50 ℃，酶解时间 2.0 h， 植酸酶 3 添加量 0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%、2.4%，其余操作同 1.5.1。

1.5.4 酶解时间对米糠粕中植酸降解率的影响料水比 1：3，酶解 pH 4.7，酶解温度 50 ℃，植酸酶3 添加量 1.8%， 酶解时间 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，其余操作同 1.5.1。

1.6 正交试验 在单因素试验的基础上，以植酸降解率为指标，对植酸酶3 酶解pH、酶解温度、酶添加量以及酶解时间设计四因素三水平L9（34）正交优化试验， 以确定植酸酶3 体外酶解米糠粕的工艺条件。

1.7 植酸降解验证试验 对正交试验获得的最佳酶解条件进行验证试验， 并参照食品安全国家标准-食品中肌醇的测定GB 5009.270-2016 检测肌醇含量。

1.8 数据统计分析 试验数据经Excel 2010 进行整理后， 采用SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析方法（one-way ANOVA），并利用 Duncan’s 法进行多重比较，P ＜0.05 为差异显著。

2 结果与讨论

2.1 植酸标准曲线绘制 以吸光度为纵坐标，植酸含量为横坐标，绘制标准曲线见图1。

图1 植酸标准曲线

2.2 单因素试验

2.2.1 植酸酶在不同pH 条件对米糠粕中植酸降解率的影响 本试验首先研究了不同pH 条件下3 种植酸酶的酶解效果，结果如图2 所示。 植酸酶1、植酸酶2、植酸酶3 对米糠粕中植酸的降解率均是随着pH 的增加呈现先升高后降低的趋势，在pH 为4.7 时， 米糠粕中植酸的降解率最高，分别为86.9%、89.4%、92.8%。 pH 3.9 时的植酸降解率均高于pH 5.5，表明只有当酶解体系酸性降低到一定程度时， 植酸酶对米糠粕中植酸的降解效果才更优。植酸酶3 不仅酶解效果最好，且对酸性环境的耐受力也最强， 因此选择该酶进行后续试验。

图2 不同pH 条件下3 种植酸酶对米糠粕中植酸降解率的影响

2.2.2 酶解温度对米糠粕中植酸降解率的影响由图3 可知，随着酶解温度的升高，植酸降解率呈现先升高后降低的趋势，在50 ℃时，植酸降解率最高， 低于50 ℃时的酶解效果优于高于50 ℃的酶解效果，结合多重比较分析结果，选取40、45、50 ℃三个水平进行正交试验。

图3 酶解温度对米糠粕中植酸降解率的影响

2.2.3 酶添加量对米糠粕中植酸降解率的影响由图4 可知， 当植酸酶3 添加量从0.3%增加到1.2%时，植酸降解率差异显著，随着酶量继续增加到1.8%，植酸降解率没有继续升高，当酶量增加到2.1%时， 植酸降解率开始出现下降趋势，为了进一步考察最适酶添加量， 选取1.2%、1.5%、1.8%三个水平进行正交试验。

图4 酶添加量对米糠粕中植酸降解率的影响

2.2.4 酶解时间对米糠粕中植酸降解率的影响由图5 可知， 当酶解时间从0.5 h 增加到1.5 h时，植酸降解率差异显著，随着酶解时间继续延长，植酸降解率开始有下降趋势，当酶解时间增加到3.5 h 时，植酸降解率达到最大值，之后又出现下降趋势， 为了进一步考察最适酶解时间， 选取1.5、2.0、3.5 h 三个水平进行正交试验。

图5 酶解时间对米糠粕中植酸降解率的影响

2.3 正交试验结果分析 在单因素试验的基础上，进行正交试验，试验设计和结果见表1，方差分析结果见表2。 由表1、表2 数据可知，酶解pH（P ＜ 0.001）、酶解温度（P ＜ 0.001）、酶解时间（P ＜0.001）均是影响植酸降解率的极显著因素，酶添加量（P ＜0.05）是影响植酸降解率的显著因素。植酸酶3 体外降解米糠粕中植酸的最适条件是A2B3C3D3，即酶解 pH 4.7、酶解温度 50 ℃、植酸酶添加量1.8%、酶解时间3.5 h。

表1 正交试验设计与结果

表2 正交试验方差分析

2.4 酶解验证试验结果 将米糠粕与水按照1：3（g/mL） 的比例混合， 用 1 mol/L 的 HCl 调 pH 为4.7， 加入1.8%（酶的质量/米糠粕质量） 的植酸酶3，50 ℃酶解 3.5 h，反应结束后，沸水浴灭酶，样品85 ℃烘干，测定植酸降解率为94.2%，肌醇含量为1.9%。 表明米糠粕中85%以上的植酸均转化为肌醇，本研究确定的酶解工艺在显著降解米糠粕中植酸抗营养因子的同时，提高了米糠粕的营养价值。

3 结论

本研究通过单因素和正交试验， 确定了米糠粕中植酸体外降解的最优酶解条件为： 植酸酶3添加量1.8%、酶解pH 4.7、酶解温度50 ℃、酶解时间3.5 h。 该条件下， 米糠粕中植酸降解率为94.2%，肌醇生成量为1.9%。