负载姜黄素纳米粒子冷鲜肉抗氧化可食用膜的制备及表征

延梦瑶， 沈 文*， 刘树兴， 葛雪梅， 敖 芬， 吴立新

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.南京林业大学 轻工与食品工程学院， 江苏 南京 210037)

0 引言

冷鲜肉是畜禽屠宰后经过冷却工艺处理，并在经营过程中环境温度始终保持0 ℃～4 ℃的肉[1].然而，制冷条件不能完全抑制微生物的生长和繁殖，大量蛋白质和脂质容易氧化变质，很难达到较长的保质期[2].因此，必须采用简单的加工和包装，以保持产品良好的外观和属性，延长其货架期.

近年来，可食用膜[3,4]被人们所关注到，它在满足冷鲜肉需求和延长其货架期中有巨大的潜力，它不影响冷鲜肉的再分割与烹调，方便了冷鲜肉的加工.因此，冷鲜肉的抗氧化可食用薄膜的开发越来越受到重视[5-8].此外，由于与原始食品成分的相互作用，将抗氧化剂直接添加到食品中可能导致其快速氧化降解.纳米粒子可以提供高负载能力和稳定性、持续释放以及跨细胞膜和生物屏障携带亲水性和亲脂性物质的能力[9]，有利于抗氧化剂作用于冷鲜肉时发挥更优作用.张力[10]用自组装制备丁香酚纳米微粒应用于冷鲜肉，发现丁香酚具有抗氧化活性，能有效防止猪肉中肌球蛋白的交联变性，抑制其持水力下降，对冷鲜肉的贮藏保鲜有改善作用.利用纳米技术开发绿色、可食的材料，不仅可以保护食物感官特性，还能保证营养价值，延长货架期[11].从Sekhon[12]的研究中发现，将纳米粒子加入可食用膜中具有双重优势：一是对于食物来说，食品表面的氧化作用最为强烈，纳米粒子的加入能够提高食品包装材料的性能，并能够持续释放针对食品表面的抗氧化剂.二是从包装材料中控制释放抗氧化剂可以延长食品的保质期.因此，利用纳米技术，开发出一种含抗氧化剂纳米粒的抗氧化可食用膜可以被认为是克服这些限制的新策略.

本研究利用壳聚糖(Chitosan，CS)和三聚磷酸钠(Sodium tripolyphosphate，TPP)之间的离子交联作用，以疏水性多酚结构的姜黄素(Curcumin，Cur)为功能因子制备了姜黄素纳米粒子(Curcumin nanoparticles，CNPs).选用具有良好阻隔性能和机械性能的羧甲基纤维素钠(Carboxymethyl cellulose，CMC)作为成膜材料，将CNPs加入CMC膜中制备了抗氧化羧甲基纤维素可食用膜(CMC/CNPs).研究了不同浓度CNPs加入CMC薄膜中对厚度、力学性能的影响，并用扫描电镜(SEM)、傅里叶红外光谱(FTIR)和X-射线衍射(XRD)对其进行表征，并评价了其抗氧化活性和探究了不同相对湿度(Relative humidity，RH)对Cur在CMC/CNPs膜中释放的影响.

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 主要材料

姜黄素(Cur，纯度≥98.0 %，博美生物技术有限公司)；壳聚糖，食品级，购买于青岛金华甲壳制品有限公司；羧甲基纤维素钠，食品级，购买于国药集团化学试剂有限公司；三聚磷酸钠、甘油、聚乙二醇400、无水乙醇、硝酸镁、氯化钠，分析纯，购买于国药集团化学试剂公司.

1.1.2 主要仪器

AI-7000-NGD伺服高低温控制多功能拉力试验机，上海发瑞仪器科技有限公司；X射线衍射仪，日本理学Rigaku公司；S4800场发射扫描电镜，日本理学Rigaku公司；VECTOR-22傅立叶红外光谱仪，德国布鲁克Bruker公司；UV-1800型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司等.

1.2 制备方法

1.2.1 CNPs的制备

将适量的Cur粉末溶于无水乙醇中，制备不同浓度的Cur溶液.称取0.900 g CS粉末溶于100 mL的1%的醋酸溶液中配置0.9%的CS溶液，称取1.200 g的TPP粉末溶于100 mL的容量瓶中制备浓度为1.2%的TPP溶液.在高速搅拌条件下，取1 mL制备好的不同浓度Cur溶液加入到20 mL 0.9%的CS溶液中，形成混合溶液.在500 r/min的磁力搅拌下，通过恒流泵以3 mL/min向混合溶液中按1∶1(CS∶TPP)的体积比滴加1.2%的TPP溶液，CNPs自发形成.在机械搅拌30 min下获得具有透明黄色的溶液，然后用4 000 r/min离心15 min获得，随后将该CNPs用于薄膜制备.

1.2.2 CMC/CNPs可食用膜的制备

首先，称取2.000 g CMC粉末与100 mL蒸馏水混合，并在50 ℃下搅拌以使其完全溶解，同时，添加1 mL甘油和1 mL聚乙二醇400作为增塑剂形成混合溶液.将先前制备好的不同浓度的CNPs溶液(分别含有0.250 mg，0.375 mg、0.500 mg、0.625 mg、0.750 mg的Cur)以1∶10的体积比添加到混合溶液中.然后，继续在50 ℃下搅拌1 h并通过超声脱气10 min获得所需的薄膜溶液.最后，将成膜液通过流延法铺于玻璃板上，在35 ℃下干燥24 h，揭下.在实验使用之前，将取下的薄膜在干燥器(温度25 ℃，RH为50 %)中平衡至少48 h.采用与对照相同的方法制备不含CNPs的空白CMC膜.CMC/CNPs可食用膜制备用量在表1中显示.将用不同浓度CNPs溶液(分别含有0.250 mg，0.375 mg、0.500 mg、0.625 mg、0.750 mg的Cur)制备的CMC膜命名为CMC/CNPs-0.250，CMC/CNPs-0.375，CMC/CNPs-0.500，CMC/CNPs-0.625，CMC/CNPs-0.750.

表1 CMC/CNPs可食用膜的制备用量

1.3 CMC/CNPs可食用膜的测定及表征

1.3.1 厚度的测定

用厚度计(DR86,山东威海量具有限公司)测量薄膜厚度，将薄膜从玻璃板(25.4 mm×76.2 mm)上剥离，测量薄膜的厚度.在每个薄膜上随机取五个位置进行测量，至少重复3次，取平均值.

1.3.2 力学性能的测试

使用伺服高低温控制多功能拉力试验机(AI-7000-NGD,上海发瑞仪器科技有限公司)测量薄膜的抗拉强度(TS)和断裂伸长率(Eb).取薄膜样品(76.2 mm×25.4 mm)放入伺服高低温控制多功能拉力试验机中，固定膜的上端与下端后，测试前在仪器上输入膜的规格，然后对多功能拉力试验机的参数进行设置，具体参数为：夹具距离为40 mm，标点距离为40 mm，拉伸速率为 10 mm/min，这薄膜一直拉到破为止，对每个薄膜至少重复测量3次，取平均值.

1.3.3 SEM

通过扫描电子显微镜(S4800，日本理学Rigaku公司)观察薄膜的表面形貌.将薄膜样品粘贴在导电胶上，然后在薄膜上喷金处理，以观察表面形态.

1.3.4 FTIR

使用傅里叶变换红外光谱仪(VECTOR-22，德国布鲁克Bruker公司)对薄膜的基本结构信息进行表征，采用薄膜法制样，取相同厚度样品，在50 ℃烘24 h后进行测试以排除样品质量、含水量对测试的影响，扫描波长范围4 000～500 cm-1，分辨率为4 cm-1.

1.3.5 XRD

使用X-射线衍射仪(Smart Lab 9kW，日本理学Rigaku公司)对薄膜进行表征.将制备好的薄膜样品裁剪成10 mm×10 mm的形状，用胶带固定在样品架上，工作电压和电流分别是40 kV、60 mA，样品在散射角(2θ)范围内，扫描速度为30 °/min，从5 °到60 °，扫描步长为0.01 °，在该条件下记录数据，得到薄膜样品的图谱.

1.4 DPPH法测定薄膜的自由基清除活性

通过DPPH自由基清除试验测定CMC/CNPs可食用膜的自由基清除活性，首先，将7.8 mg DPPH试剂溶解在100 mL的无水乙醇中，制备2×10-4M的DPPH溶液.将CMC/CNPs可食用膜(10 mm×10 mm)放入50 mL的离心管中，依次加入2 mL无水乙醇和2 mL DPPH溶液，将离心管避光储存30 min，并用紫外可见分光光度计(UV-1800，上海美谱达仪器有限公司)在517 nm处测定所得溶液的吸光度.使用下面公式(1)来计算CMC/CNPs可食用膜的DPPH自由基清除活性：

(1)

式(1)中：A0为无膜的DPPH乙醇溶液的吸光度；Ai为CMC/CNPs膜的DPPH溶液吸光度.

1.5 释放实验

大多数发表的研究都是模拟液体食品，而没有在不同相对湿度条件下测试真正的食品.因此，本实验设置不同相对湿度来研究CMC/CNPs可食用膜中Cur的释放.室温条件下(25 ℃)，在密闭环境中分别使用硅胶、硝酸镁、氯化钠、水蒸汽制备饱和盐溶液，将RH固定在25±5、50±5、75±5、95±5.将制得的CMC/CNPs-0.250，CMC/CNPs-0.375，CMC/CNPs-0.500，CMC/CNPs-0.625，CMC/CNPs-0.750可食用膜放入不同RH条件下自然释放，隔0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、12 h、24 h、48 h、60 h用棉签蘸取所有可食用膜表面的Cur，溶到5 mL的无水乙醇溶液中，超声10 min加速溶解，再用紫外分光光度计在426 nm下测定Cur的吸光度，利用标准曲线计算Cur的含量，计算Cur的释放率，对每个样品进行三次重复.用下面公式(2)计算薄膜中Cur的累计释放率：

(2)

式(2)中：mi是样品中Cur的初始含量；V是稀释Cur所用无水乙醇的体积(5 mL);Ci是求和公式中Cur的浓度变量；Cn是第n个样品中Cur的浓度.

2 结果与讨论

2.1 薄膜的厚度与机械性能分析

表2显示了不同浓度CNPs的加入对CMC膜厚度和机械性能的影响.薄膜的厚度很大程度上取决于薄膜的性质和组成，从表2可以看出CMC/CNPs可食用膜的厚度在0.117 mm到0.137 mm之间变化不大，加入CNPs会增加CMC膜的厚度.

薄膜的力学性能与聚合物薄膜中形成的网络中分子间和分子内的相互作用力有关[13].抗拉强度(TS)是通过测量拉伸应力下试样的断裂点来确定的，作为承受拉力的能力，可以用来描述试样的强度.断裂伸长率(Eb)是试样受到外力时，长度从其原始长度到断裂点长度的延伸，这与聚合物材料的弹性有关，可以用来描述试样的柔韧性[14].表2统计比较了加入不同浓度CNPs的CMC膜的机械性能.从表2可以看出，与CMC膜相比，随着CNPs浓度的增大，CMC/CNPs膜的TS从3.99±0.98 MPa增加到12.98±2.95 MPa，CMC/CNPs膜的Eb从16.55±2.91 %增加到27.24±1.38 %，TS的增加可能因为CNPs加入CMC的聚合物网络中，减小了大分子链间的距离，使薄膜结构更加紧凑.随着CNPs浓度的增大，体系中氢键数目增多，分子内和分子间的作用力增强，使得CMC/CNPs膜的TS增大[15].Ruan等[16]研究发现表没食子儿茶素没食子酸酯加入后通过氢键交联海藻酸钠和羧甲基纤维素，填补了海藻酸钠和羧甲基纤维素骨架之间的空隙，形成致密的网络结构，从而增加了可食用膜的TS.Nieto-Suaza等[17]的研究中发现加入纳米粒子后提高了淀粉膜的TS，是因为纳米粒子具有高比表面积，尺寸小，淀粉纳米粒子的表面含有大量羟基，与聚合物基质形成更多的氢键，提高了纳米粒子和聚合物基质之间的相互作用，使得应力从聚合物基质转移到纳米粒子，从而增强了薄膜的强度.因此，加入CNPs后，CMC/CNPs膜的抗拉强度增加.

Eb值的增加表明CNPs的加入使CMC膜具有更高的柔韧性，膜配方成分甘油和聚乙二醇400在一定程度上也起到了增强薄膜流动性的作用.上述结果表明，在CMC膜液中加入CNPs，可以改善CMC膜的机械性能.此外，CNPs可能发挥增塑剂作用并增加聚合物的流动性.

表2 CMC/CNPs可食用膜的厚度和机械性能

2.2 SEM分析

采用SEM观察CMC膜和CMC/CNPs-0.250膜的表面形貌，如图1(a)所示，CMC膜表面虽有褶皱产生，但无裂痕，无孔洞，可能是因为在干燥过程中由于水分蒸发而发生了皱缩.然而，CMC/CNPs-0.250(图1(b))膜褶皱减少，能看见凸起的小颗粒，可能是因为在干燥过程中纳米粒子中的Cur释放了出来，然而，这种形貌并没有降低CMC/CNPs-0.250膜的机械性能.结果表明，添加CNPs会影响CMC膜的形貌，但是没明显的相分离现象.

(a)CMC膜 (b)CMC/CNPs-0.250膜图1 CMC膜和CMC/CNPs-0.250膜的SEM图

2.3 FTIR分析

薄膜的FTIR光谱在4 000～500 cm-1范围内如图2所示.由图2可知，FTIR光谱图用于表征CMC膜和CMC/CNPs膜中官能团的变化.CMC膜在3 404 cm-1、2 910 cm-1、1 654 cm-1、1 430 cm-1、1 091 cm-1波长处有特征峰，CMC/CNPs-0.250膜在3 440 cm-1处的特征峰与-OH基团的伸缩振动和分子间和分子内氢键的作用有关[18].随着CNPs的加入，拉伸频率向更高的波长移动(3 404 cm-1到3 440 cm-1)，峰值变宽，随着CNPs浓度的增大，该处的特征峰变的更宽更清晰，振幅逐渐增大.结果表明，所制备的CMC/CNPs膜中具有较强的-OH基团，分子间和分子内的氢键作用增强.CMC/CNPs-0.250膜在2 925 cm-1处的特征峰与C-H的伸缩振动有关，在1 660 cm-1和1 448 cm-1附近处的特征峰分别归因于不对称COO-的伸缩振动和对称COO-的伸缩振动[16]，峰值变小.在1 105 cm-1附近处的特征峰与醚键的不对称伸缩振动有关[6].此外，在CMC/CNPs膜的红外光谱图中，没有观察到额外的峰.这些结果表明，CNPs和CMC之间存在相互作用，CNPs主要为薄膜提供-OH基团，分子间和分子内的氢键作用增强，分子间作用力增大，有利于CMC/CNPs膜的力学性能增强，这与力学性能表征结果保持一致.

a：CMC；b：CMC/CNPs-0.250； c：CMC/CNPs-0.375；d：CMC/CNPs-0.500；e：CMC/CNPs-0.625；f：CMC/CNPs-0.750图2 CMC/CNPs膜的傅里叶红外图谱

2.4 XRD分析

图3显示了不同浓度CNPs嵌入CMC膜的X射线衍射图.由图3可知，对于CMC膜衍射图谱，CMC膜在 15～28 °处出现宽峰，说明CMC存在非晶体结构[19].在 CMC 膜中加入不同浓度CNPs后，没有观察到任何新的特征峰，CMC/CNPs-0.250，CMC/CNPs-0.375，CMC/CNPs-0.500，CMC/CNPs-0.625，CMC/CNPs-0.750膜的 XRD 图谱与 CMC膜的几乎是一样的.结果表明：CMC的无定形结构并没有受CNPs加入的影响.

图3 CMC/CNPs膜的X-射线衍射图谱

2.5 释放实验分析

图4显示了在RH为25±5、50±5、75±5、95±5条件下CMC/CNPs-0.250、 CMC/CNPs-0.375、CMC/CNPs-0.500、CMC/CNPs-0.625、CMC/CNPs-0.750膜中Cur的释放特性曲线.图4(a)显示的是CMC/CNPs-0.250膜在不同RH下的释放曲线.由图可以看出，在RH为95±5的条件下，在前2 h内迅速上升，释放率达到47.81%，在接下来的2天内持续释放，释放率到81.41%，低于最初2个小时内的释放率.在RH为75±5的条件下，CMC/CNPs膜中Cur的释放率在前2 h为18.82%，在随后的2天内的释放率达到52.62%，高于前2 h的释放率.在RH为50±5的条件下，CMC/CNPs膜中Cur的释放率在前2 h内为14.93 %，在之后的2天内，释放率上升到41.67 %.在RH为25±5的条件下，CMC/CNPs膜中Cur的释放率相对较低，呈现缓慢增长的趋势，在前2 h内释放率为1.56%，在之后的2天内，释放率保持平稳达到6.5 %，但相对高于前2 h内的释放率.结果表明，RH越大，Cur在前2 h内的释放率越大，可能是因为密闭环境中的水分子渗透到薄膜的表面，薄膜开始溶胀，使得Cur更容易释放出来.

水分子能够降低生物材料的玻璃化转变温度并增加其自由体积，因此，它可以被归类为“天然”的增塑剂.在Barbut等[20]的研究中发现，RH可能会影响薄膜的机械性能，是因为薄膜中的水具有塑化作用.在Kurek等[21]的研究中也发现RH对香芹酚的释放有影响是因为壳聚糖基质被水塑化，水渗透到薄膜表面，薄膜表面开始出现裂缝，从而释放香芹酚.此外，Benbettaieb等[22]发现水可以轻松且紧密地与极性或亲水性生物聚合物结合，当水占据高能极性结合位点时，它不容易被其他物质替换.因此当环境中的RH较高时，水蒸气的积累导致活性物质的释放.

从图4(b)～(e)可以看出，CMC/CNPs-0.375、CMC/CNPs-0.500、CMC/CNPs-0.625、CMC/CNPs-0.750膜中Cur的释放模式几乎相似，其特征是在RH为95±5的条件下前2 h内Cur的释放率迅速上升，在之后的2天内持续释放.在RH为25±5、50±5、75±5的条件下，CMC/CNPs膜中Cur在前2 h的释放率低于在后2天内的释放率，呈现缓慢释放的趋势.这是因为Cur被包埋形成纳米粒子，同时CMC的存在增加了Cur扩散路径的曲折性，增加了薄膜结构的紧凑性，从而阻碍了Cur的释放.而随着时间的延长，膜的结构可能更加疏松，导致分子间的作用力大大降低，Cur也被更多得释放出来.由此可以看出，RH对活性物质的释放影响很大，当包装置于RH较高的地方时，尤其是冷鲜肉，水蒸气的积累会诱导活性物质的释放，活性物质包埋形成纳米粒子的形式加入到成膜溶液中可以延缓它的释放，从而实现其功能效果.

(a)CMC/CNPs-0.250

(b)CMC/CNPs-0.375

(c)CMC/CNPs-0.500

(d)CMC/CNPs-0.625

(e)CMC/CNPs-0.750图4 不同湿度下Cur的释放图

2.6 抗氧化性分析

抗氧化活性是检测薄膜的重要指标，本研究采用DPPH自由基清除活性检测不同浓度CMC/CNPs膜的抗氧化活性.在温度为25 ℃、RH为75的条件下，以分别添加0.250 mg，0.375 mg、0.500 mg、0.625 mg、0.750 mg Cur的CMC膜作为对照组.从图5可以看出，CMC/CNPs膜的DPPH自由基清除活性随着CNPs的浓度的增加而增加.尤其是CMC/CNPs-0.750膜表现出较高的抗氧化活性(85.22 %)，而CMC/CNPs-0.250表现出相对较低的抗氧化活性(51.29%)，CMC/CNPs膜的DPPH自由基清除能力高于对照组.结合上述释放实验，Cur被包埋形成CNPs，当RH较高时，水分会逐步进入薄膜中，其过程会导致薄膜溶胀，使得Cur从膜中更加缓慢的被释放出来.而随着CNPs浓度的增大，Cur的含量也更多，清除DPPH自由基的能力也随之提高.因此，把CNPs加入CMC膜中仍具有很强的抗氧化活性.主要原因是CNPs的形成，Cur得到了有效的保护.

图5 CMC/CNPs膜的DPPH自由基清除活性图

3 结论

Cur与CS和TPP形成的CNPs成功的结合到可食用性CMC膜中，采用流延法成功制备了负载CNPs的抗氧化CMC/CNPs可食用膜.CNPs的加入提高了CMC薄膜的TS和Eb.SEM图像表明添加CNPs会影响CMC膜的形貌，但没有明显的相分离现象.FTIR和XRD表明CNPs和CMC之间存在相互作用.DPPH自由基清除试验表明CMC/CNPs膜比空白CMC膜具有更高的抗氧化活性.

此外，不同RH下CMC/CNPs膜中Cur的释放情况不同.RH对活性物质的释放影响很大，当薄膜置于RH较高的地方时，尤其是冷鲜肉，水蒸气的积累诱导活性物质的释放，活性物质包埋形成纳米粒子的形式加入到成膜溶液中可以延缓它的释放.因此，在实际应用中，CMC/CNPs可食用膜是延缓冷鲜肉氧化变质，延长其货架期的一种方法.