乳腺癌组织miR-92a、KLF4 mRNA的表达及与临床病理参数、预后的关系*

胡学丽，范先成

（长沙市第一医院乳甲外科，湖南长沙410005）

乳腺癌是女性最常见且病死率最高的恶性肿瘤，2020年全球新发乳腺癌病例226.1 万，死亡68.5 万，我国新发乳腺癌病例41.6 万，死亡11.7 万，严重威胁女性生命健康[1]。近年来乳腺癌的治疗取得较大进展，其预后相对肺癌、结直肠癌、肝癌等恶性肿瘤更好，但3%～10%的乳腺癌患者在确诊时已经存在转移，30%早期乳腺癌可进展为晚期乳腺癌，其5年生存率＜20%[2-3]。因此，有必要进一步研究乳腺癌生物学和分子机制，识别乳腺癌新的治疗靶点。miRNA 是一种单链非编码内源性RNA 分子，能调控靶基因表达，参与肿瘤的发生、发展[4]。研究报道，miR-92a 在肝细胞癌、胃癌等恶性肿瘤中异常表达，与癌细胞增殖、迁移、侵袭有关[5-6]。细胞周期调控异常、上皮间质转化、肿瘤干细胞样特性维持在肿瘤发生、发展中发挥重要作用，KLF4 是一种锌指结构转录因子，其参与调控细胞周期、上皮间质转化、肿瘤干细胞样特性等。有研究报道KLF4 参与卵巢癌、胃癌等恶性肿瘤进展[7-8]，且miR-92a、KLF4 mRNA 在乳腺癌组织中表达上调[9-10]。本文探讨miR-92a、KLF4在乳腺癌组织中的表达及与临床病理参数、预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月—2016年9月长沙市第一医院乳甲外科收治的124 例乳腺癌患者。收集患者癌组织和距癌组织＞5 cm 的癌旁组织。患者年龄32～72 岁，平均（50.54±8.68）岁；肿瘤直径≥5 cm 有45 例，＜5 cm 有79 例；分化程度：低分化47 例，中高分化77 例；雌激素受体阳性66 例，阴性58 例；孕激素受体阳性74 例，阴性50 例；临床分期[11]：Ⅰ、Ⅱ期83例，Ⅲ、Ⅳ期41例；有淋巴结转移44 例，无淋巴结转移80 例。纳入标准：①经术后病理检查确诊为乳腺癌；②初诊，未接受任何抗肿瘤治疗；③病理资料和随访资料完整；④患者及家属均知情同意。排除标准：①合并其他肿瘤；②年龄＜18 岁；③严重心、肝、肾等脏器疾病；④全身感染性疾病。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

从液氮中取出50 mg 癌组织、癌旁组织研磨，使用Trizol 试剂盒提取总RNA，Narodrop 验证cDNA 浓度及纯度，将OD260/OD280 调整为1.8～2.0，TaKaRa 试剂盒转录合成cDNA，使用qRT-PCR 试剂盒进行qRT-PCR 扩增。miR-92a 正向引物：5'-GATCTGGAT TGATATCAT-3'，反向引物：5'-TTCGAATGAGGACTA ATA-3'，分别为18 bp 和20 bp；KLF4 正向引物：5'-ATGGCTGGAATACATGCT-3'，反向引物 ：5'-ACTCGTAAGCCTGTGCAG-3'，分别为21 bp 和22 bp；miR-92a内参U6正向引物：5'-TTACTGATTCGCTAGC AT-3'，反向引物：5'-CCGATTCTACGCTCGTGA-3'，分别为21 bp 和25 bp；KLF4 内参GAPDH 正向引物：5'-GAGCCTTGAAGACTTGAT-3'，反向引物 ：5'-CTACGGACGACTCTGAAT-3'，分别为19 bp 和20 bp。反应体系：5.0 μL SYBR Premix Ex Taq，0.2 μL 引物，0.2 μL ROX 参考染料，1.0 μL cDNA 模板，3.4 μL 经DEPC 处理水。反应条件：95℃预变性90 s、95℃变性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸15 s，共40 个循环，采用2-ΔΔCt法计算各组织中miR-92a、KLF4 mRNA 相对表达量。

1.3 随访

患者出院后通过门诊或电话随访5年，截止至2021年9月，随访终点为治疗后至任何原因导致死亡的时间或随访截止的时间。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 26.0 统计软件，计数资料以例（%）表示，比较用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；相关性分析用Pearson 法；Kaplan-Meier法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验；多因素Cox 回归模型分析患者预后不良的危险因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织与癌旁组织中miR-92a、KLF4 mRNA相对表达量及其相关性

乳腺癌组织中miR-92a、KLF4 mRNA 相对表达量分别为（1.627±0.436）和（2.270±0.569），癌旁组织分别为（1.007±0.192）和（1.104±0.144），癌组织和癌旁组织中miR-92a、KLF4 mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（t=13.910 和21.227，均P=0.000），癌组织高于癌旁组织。Pearson 相关性分析显示，乳腺癌组织中miR-92a mRNA 与KLF4 mRNA表达呈正相关（r=0.612，P=0.000）。见图1。

图1 相关性散点图

2.2 不同临床病理特征乳腺癌患者的miR-92a、KLF4 mRNA相对表达量比较

不同临床分期、有无淋巴结转移乳腺癌患者miR-92a、KLF4 mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），临床分期Ⅲ、Ⅳ期和有淋巴结转移患者的miR-92a、KLF4 mRNA 表达水平高于临床分期Ⅰ、Ⅱ期和无淋巴结转移患者。不同年龄、肿瘤直径、分化程度、雌激素受体、孕激素受体患者miR-92a、KLF4 mRNA 相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同临床病理特征乳腺癌患者的miR-92a、KLF4 mRNA相对表达量比较 （±s）

表1 不同临床病理特征乳腺癌患者的miR-92a、KLF4 mRNA相对表达量比较 （±s）

临床病理特征年龄≥50岁＜50岁肿瘤直径≥5 cm＜5 cm分化程度低分化中、高分化n miR-92a mRNA t 值P 值KLF4 mRNA t 值P 值50 74 1.667±0.379 1.596±0.476 0.858 0.393 2.298±0.568 2.249±0.573 0.454 0.651 45 79 1.696±0.422 1.583±0.441 1.368 0.174 2.332±0.636 2.230±0.521 0.930 0.354 47 77 1.707±0.429 1.571±0.435 1.657 0.100 2.370±0.607 2.200±0.534 1.577 0.118

续表1

2.3 miR-92a、KLF4 mRNA 表达与乳腺癌患者生存率的关系

乳腺癌患者累积生存率为70.97%，以miR-92a、KLF4 mRNA 相对表达量均值（分别为1.627 和2.270）为基准将患者分为高表达、低表达。高miR-92a 表达患者（55 例）和高KLF4 mRNA 表达患者（58例）的累积生存率分别为58.18%（32/55）、60.34%（35/58），低miR-92a 表达患者（69 例）、低KLF4mRNA 表达患者（66 例）分别为81.16%（56/69）、80.30%（53/66），经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=8.833、8.652，均P=0.003），高表达患者低于低表达患者。见图2。

图2 高、低miR-92a、KLF4 mRNA表达乳腺癌患者Kaplan-Meier生存曲线

2.4 乳腺癌患者预后不良影响因素的多因素Cox回归分析

以低分化肿瘤（是=1，否=0）、临床分期Ⅲ、Ⅳ期（是=1，否=0）、淋巴结转移（是=1，否=0）、miR-92a（≥1.627= 1，＜1.627=0）和KLF4 mRNA（≥2.270=1，＜2.270= 0）作为自变量，以是否死亡作为因变量（是=1，否=0），进行多因素Cox回归分析。结果显示，临床分期Ⅲ、Ⅳ期[=3.716（95% CI：1.765，7.826）]、淋巴结转移[=3.021（95% CI：1.341，6.803）]、miR-92a mRNA 相对表达量≥1.627 [=3.401（95% CI：1.358，8.515）]、KLF4 mRNA 相对表达量≥2.270 [=2.059（95% CI：1.026，4.133）]是乳腺癌患者预后不良的危险因素（P＜0.05）。见表2。

表2 乳腺癌患者预后不良影响因素的多因素Cox回归分析参数

3 讨论

乳腺癌主要由乳腺上皮细胞增殖失控进而恶变形成，是严重影响女性身心健康的恶性肿瘤，其发生、发展与多种基因异常表达密切相关，近年来手术、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗等多学科综合治疗策略极大地改善了患者的预后，但晚期乳腺癌仍然难以治愈[3]。同时放疗作为降低保乳手术和高危乳房切除患者复发和延长生存期的重要手段，在治疗过程中也易出现获得性抵抗，导致乳腺癌复发或转移[12]。肿瘤是多基因、多机制共同参与的复杂过程，近年来分子生物学发展为肿瘤治疗提供了新的途径，但乳腺癌在基因水平上的治疗仍然缺乏有力证据，有必要进一步探索乳腺癌增殖、转移、复发相关机制，对完善乳腺癌治疗策略和评估乳腺癌患者预后具有重要意义。

miRNA 是一类内源性长约18～25 个核苷酸的非编码单链小分子RNA，可在3'-非翻译区与靶基因的mRNA 结合，导致靶基因转录后沉默，从而调控靶基因的表达，在包括乳腺癌在内多种肿瘤中发挥癌基因或抑癌基因功能[4]。如miR-370-5p 能靶向下调LUC7 样3 前体剪接因子抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭能力[13]。miR-92a 为高度保守的miR-17-92 基因簇一员，位于人染色体13q31.3。近年研究表明其参与多种恶性肿瘤进展，如ZHENG 等[14]报道，miR-92a 在前列腺癌中表达上调，能通过调控第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因/蛋白激酶B 信号通路促进前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。WANG 等[15]研究报道，miR-92a 在宫颈癌中表达上调，其通过下调磷脂酰肌醇-3 激酶调节亚基1 促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。本研究结果显示，乳腺癌组织中miR-92a 表达与临床分期和淋巴结转移有关，其机制可能与miR-92a 能靶向抑制BTG2。BTG2是BTG/TOB 基因家族一员，作为肿瘤抑制因子参与癌细胞多种生物学行为，能通过调节哺乳动物雷帕霉素靶标、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B 等信号通路抑制乳腺癌细胞发生、发展[16]。HUANG 等[17]研究报道，miR-92a 能靶向抑制BTG2 表达促进乳腺癌细胞增殖和转移。本研究结果显示，与低miR-92a mRNA 表达患者比较，高miR-92a mRNA 表达患者生存率显著降低，多因素Cox 回归也显示，miR-92a mRNA 相对表达量≥1.627患者死亡风险增加3.401 倍，说明miR-92a mRNA表达上调与乳腺癌患者预后不良密切相关，可能成为评估乳腺癌预后的标志物。

锌指蛋白是人体最大的转录家族，其促癌或抑癌作用参与恶性肿瘤发生、发展[18]。KLF4 是一种含锌指修饰结构的蛋白，可通过结合CACCC 元件和其他DNA 序列调节基因表达，由于KLF4 具备转录抑制和激活2 种结构域，因此可以正向或负向调节下游靶基因，在肿瘤进展过程中发挥促癌或抑癌作用。如KLF4 mRNA 在胰腺癌中表达下调，上调KLF4 mRNA 表达能抑制胰腺癌细胞生长和转移[19]。但在非霍奇金淋巴瘤中，KLF4 mRNA 表达上调与非霍奇金淋巴瘤细胞化疗抗性、迁移和生存率降低密切相关[20]。本研究结果显示，乳腺癌组织中KLF4 表达与临床分期和淋巴结转移有关，说明KLF4 表达升高与乳腺癌恶性进展有关，其机制可能与KLF4 能通过维持肿瘤干细胞样特性有关。肿瘤干细胞具备自我复制和多细胞分化等能力，是促进肿瘤转移、复发的肿瘤细胞。目前研究认为，KLF4 的抑癌作用主要与KLF4 能抑制上皮-间质转化有关，而促癌作用与其能通过维持正常干细胞与肿瘤干细胞的端粒酶活性，进而维持肿瘤干细胞样特性有关[21-22]。近年多项研究也显示，抑制KLF4 表达能抑制乳腺癌细胞干细胞特征，增强药物治疗作用[23-24]。本研究结果显示，与低KLF4 mRNA 表达患者比较，高KLF4 mRNA 表达患者生存率显著降低，多因素Cox 回归也显示，KLF4 mRNA 相对表达量≥2.270 患者死亡风险增加2.059倍，说明KLF4 mRNA 表达上调与乳腺癌患者预后不良密切相关，也可能成为评估乳腺癌预后的标志物。本研究结果还显示，乳腺癌组织中miR-92a与KLF4 mRNA 表达呈正相关，说明miR-92a 与KLF4 共同参与了乳腺癌恶性进展，可能与KLF4 为miR-92a 的下游调控靶点有关。

综上所述，乳腺癌组织中miR-92a、KLF4 mRNA 高表达，与临床分期、有无淋巴结转移有关。但本研究样本量较少，未从细胞学上分析miR-92a，KLF4 对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，还有待进一步研究。