刺山柑果风湿止痛凝胶膏对SD大鼠的一般生殖毒性

许文黎，何 江，李曙芳，王新钢，张亚娟，刘 欢，岳 娟，李建国，杨伟俊，*

(1．中国辐射防护研究院药物安全性评价中心，山西 太原 030006；2．新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830004)

刺山柑果是山柑科刺山柑(Capparis spinose L.)的果实[1]，具有较好的抗炎、镇痛、缓解关节炎等作用[2-3]，是维吾尔医学常用的传统药材。通过对刺山柑果抗炎镇痛活性部位进行筛选，研制经皮给药新剂型——刺山柑果风湿止痛凝胶膏，其药效学实验研究结果表明，其对抗炎、镇痛和抗关节炎有良好的治疗作用[4-5]，但是对于其生殖毒理方面的研究鲜见报道。本文对刺山柑果风湿止痛凝胶膏含药贴进行了一般生殖毒性研究，旨在探讨其对大鼠的一般生殖毒性，为其临床用药提供安全性评价依据。

1 材料与方法

1.1 受试品与试剂

刺山柑果风湿止痛凝胶膏(批号20171015)，每帖相当于含生药材20 g；对照品为辅料贴(批号2017 1101)，不含药材。受试品与对照品均由新疆维吾尔自治区药物研究所提供。注射用环磷酰胺(江苏盛迪医药有限公司生产，每瓶0.2 g)，氯化钠注射液(石家庄鹏海制药有限公司生产)。

1.2 主要仪器

生物显微镜CX23和CX21均为奥林巴斯(中国)投资有限公司产品；电热恒温培养箱303-00A购自北京心雨仪器仪表有限公司；游标卡尺0～150 mm购自哈尔滨量具刀具集团有限责任公司。

1.3 实验动物

SD大鼠，SPF级，250只，雌、雄各半，8～9周龄，均为未育未孕动物，开始给药时雌鼠体质量(255.1±17.3)g，雄鼠体质量(343.5±12.7)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK-(京)2016-0006，动物质量合格证号114007 00268549。饲养于中国辐射防护研究院药物安全性评价中心屏障环境内，许可证号SYXK(晋)2013-0002。

1.4 分组和给药

SD大鼠按体质量随机分为刺山柑果风湿止痛凝胶膏高(117.8 g/m2)、中(58.9 g/m2)、低(29.5 g/m2)3个剂量组、辅料对照组(辅料贴)和阳性对照组(环磷酰胺)，共5组，每组雌雄各25只。

每天给药1次，雄鼠给药首日定义为D1，雄鼠连续给药4周、雌鼠连续给药2周后，同组中的雌鼠与雄鼠按照1∶1合笼交配，交配期间持续给药；交配期间每日上午对雌鼠进行阴道涂片检查，经镜检发现精子即为交配成功，交配成功当日定义为妊娠第0天(GD0)；交配成功的雌鼠继续给药至妊娠第6天(GD6)。阳性对照组雄鼠在D1、雌鼠在D15进行腹腔注射，单次给药，剂量为0.1 g/kg。

1.5 观察指标[6-7]

记录给药期间大鼠一般状态、合笼和交配情况；交配前雄鼠和雌鼠每周称体质量2次、记录摄食量1次，孕鼠于GD0、GD3、GD6、GD10、GD14称体质量，于GD0、GD6、GD12称量摄食量；雄鼠确定交配成功后麻醉放血处死，摘取睾丸、附睾组织，分别称取质量，计算脏器系数，测量睾丸横径，进行精子计数、精子活力和形态分析；雌鼠于GD14麻醉放血处死，计录黄体数、着床数、活胎数、死胎数和吸收胎数，称取卵巢和子宫质量及胎质量(连子宫)，计算宫外增加质量和脏器系数。

1.6 统计学方法

运用SAS 9.4统计软件，实验数据用±s表示，计量资料进行方差分析；交配率、受孕率、活胎率等资料采用χ2检验，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 大鼠一般状态观察

给药期间，各组大鼠行为活动正常，未给药区域的被毛浓密有光泽，外观体征、进食及粪便等均未见明显异常，无动物死亡。

2.2 刺山柑果风湿止痛凝胶膏对大鼠各时期体质量的影响

与辅料对照组相比，刺山柑果风湿止痛凝胶膏对各剂量组大鼠的体质量无明显影响(P＞0.05)，对孕鼠体质量和妊娠期宫外增加质量亦无明显影响(P＞0.05)，见表1。

表1 刺山柑果风湿止痛凝胶膏对妊娠期孕鼠体质量的影响(g)

2.3 刺山柑果风湿止痛凝胶膏对大鼠摄食量的影响

刺山柑果风湿止痛凝胶膏各剂量组雄鼠和雌鼠的摄食情况与辅料对照组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)，阳性对照组雄鼠在D3的摄食量明显低于辅料对照组(P＜0.01)，孕鼠GD0的摄食量低于辅料对照组(P＜0.05)，结果见表2和表3。

表2 刺山柑果风湿止痛凝胶膏对雄鼠摄食量的影响(g/d，n=25)

表3 刺山柑果风湿止痛凝胶膏对雌鼠和孕鼠摄食量的影响(g/d)

2.4 刺山柑果风湿止痛凝胶膏对大鼠生殖能力的影响

刺山柑果风湿止痛凝胶膏各剂量组大鼠的交配率、妊娠率、交配成功时间与辅料对照组间的差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表4。

表4 刺山柑果风湿止痛凝胶膏对雄鼠和雌鼠生殖能力的影响(n=25)

2.5 刺山柑果风湿止痛凝胶膏对雄鼠生殖器官的影响

与辅料对照组相比，刺山柑果风湿止痛凝胶膏各剂量组对雄鼠的附睾和睾丸脏器质量、睾丸横径和附睾精子数量、精子活动度无明显影响(P＞0.05)，58.9和29.5 g/m2剂量组的附睾精子畸形率降低(P＜0.01)，3个剂量组的睾丸系数均明显降低(P＜0.01)；阳性对照组的左侧睾丸横径、附睾精子数量、附睾精子活动度、附睾系数和睾丸系数明显降低(P＜0.01)，附睾精子畸形率明显升高(P＜0.01)，见表5。

表5 刺山柑果风湿止痛凝胶膏对雄鼠生殖器官的影响(n=25)

2.6 刺山柑果风湿止痛凝胶膏对孕鼠妊娠结局的影响

与辅料对照组相比，刺山柑果风湿止痛凝胶膏对孕鼠的子宫连胎质量、平均黄体数、平均着床数、平均活胎数、平均死胎数、子宫和卵巢质量及其脏器系数均无明显影响(P＞0.05)；117.8 g/m2剂量组的着床前丢失率、吸收胎率升高(P＜0.05)，着床率和活胎率降低(P＜0.05)；29.5 g/m2剂量组的着床前丢失率明显降低(P＜0.01)，着床率明显升高(P＜0.01)；阳性对照组子宫连胎质量、平均活胎数、活胎率明显降低(P＜0.01)，平均死胎数、死胎率、平均吸收胎数、吸收胎率明显升高(P＜0.01)，见表6。

表6 刺山柑果风湿止痛凝胶膏对雌鼠妊娠结局的影响(n=25)

3 讨论

生殖毒性试验是药物非临床安全性评价的重要组成部分，一般生殖毒性试验主要通过观察药物对动物生殖功能和胚胎发育过程的影响，判断其可能对动物的精卵形成、交配、着床、胎仔的吸收和死亡以及宫内活胎发育等的毒性作用。

在本研究中，与辅料对照组相比，环磷酰胺阳性对照组雄鼠D4体质量明显降低；雄鼠在D3的摄食量明显降低；孕鼠GD0的摄食量有所降低；雄鼠的左侧睾丸横径、附睾精子数量、附睾精子活动度、附睾系数和睾丸系数明显降低，附睾精子畸形率明显升高；孕鼠的子宫连胎质量、平均活胎数、活胎率明显降低，平均死胎数、死胎率、平均吸收胎数、吸收胎率明显升高，结果与文献[8]报道的环磷酰胺对SD大鼠的作用结果较为一致，表明阳性模型建立成功，该实验系统可靠。

刺山柑果风湿止痛凝胶膏组雄性、雌性大鼠和孕鼠的一般状况、体质量、摄食量与辅料对照组相比均无明显变化，表明刺山柑果风湿止痛凝胶膏对亲代大鼠无毒性作用。

刺山柑果风湿止痛凝胶膏各剂量组的睾丸系数较辅料对照组均降低(P＜0.01)；而各剂量组附睾系数、睾丸质量与辅料对照组相比降低，但无量-效关系。结合各组体质量和附睾、睾丸质量，虽然刺山柑果风湿止痛凝胶膏各剂量组解剖时体质量和附睾、睾丸质量与辅料对照组相比差异无统计学意义，但在数值上辅料对照组在解剖时体质量较小，附睾、睾丸质量较大，故导致其附睾、睾丸系数偏大，另外结合各剂量组雄鼠的交配行为、附睾精子数量、活动度、畸形率等数值均未发生明显异常，考虑刺山柑果风湿止痛凝胶膏各剂量组的附睾、睾丸系数降低可能与个体体质量变化有关，表明刺山柑果风湿止痛凝胶膏对雄鼠生殖能力无明显影响。

与辅料对照组相比，刺山柑果风湿止痛凝胶膏高剂量组着床前丢失率升高、着床率降低，低剂量组着床前丢失率降低、着床率升高，具有一定的量-效关系；高剂量组活胎率降低、吸收胎率升高，中、低剂量组无明显变化，无量-效关系；各剂量组的平均活胎数、平均死胎数、平均吸收胎数、死胎率等均无明显变化，实验结果表明刺山柑果117.8 g/m2可能造成妊娠雌鼠的着床率和活胎率降低、吸收胎率升高，对雌鼠的生育力可能存在影响。

综上，在本实验剂量范围内，刺山柑果风湿止痛凝胶膏对雄鼠的生育力无明显毒性影响，高剂量(117.8 g/m2)刺山柑果风湿止痛凝胶膏对雌鼠的生育力存在一定影响，中(58.9 g/m2)、低(29.5 g/m2)剂量对雌鼠的生育力无明显毒性。