EGFR与HER-2在不同分子类型乳腺癌中的表达及其相关性分析

郭晓娟，王金西，牛广旭，田云霄，*

(1．邯郸市中心医院病理科，河北 邯郸056001；2．邯郸市第一医院普外四科，河北邯郸 056002)

乳腺癌是全球女性最常见的癌症，其发病率、死亡率在不断上升，而我国女性乳腺癌发病人数及死亡人数均居世界首位，分别占世界女性乳腺癌发病和死亡人数的17.6%和15.6%[1]。不同区域乳腺癌发病率、死亡率及分子类型存在差异[2]，乳腺癌中约70%～80%为浸润性导管癌(invasive ductal carcinoma，IDC)。根据2019圣加伦(St.Gallen)乳腺癌国际共识，采用免疫组化检测替代基因表达谱分析，可将浸润性乳腺癌(invasive breast carcinoma，IBC)分为Luminal A型、Luminal B型、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)过表达型及基底样乳腺癌(basal-like breast carcinoma，BLBC)。BLBC是三阴型乳腺癌(triple negative breast carcinoma，TNBC)的一种亚型。人类表皮生长因子受体(human epidermal growth factorreceptor，EGFR)家族属于酪氨酸激酶Ⅰ亚族的跨膜蛋白受体，包括EGFR(HER-1/erbB1)、HER-2(erbB2)、HER-3(erbB3)和HER-4(erbB4)[3]，其中EGFR和HER-2最常见于人类肿瘤发生过程中。目前研究证实，EGFR和HER-2可在多种人类恶性肿瘤中过度表达，且与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及血管生成密切相关[4]，并且是目前国际公认的重要治疗靶点。但二者之间是否存在某种关系，研究甚少。本文回顾性收集邯郸市中心医院650例乳腺癌患者标本，应用免疫组化方法检测EGFR、HER-2蛋白在乳腺癌组织中的表达情况，采用χ2检验及Spearman相关分析对数据进行统计学分析，发现EGFR、HER-2阳性率在乳腺浸润性导管癌显著升高，且EGFR阳性率与HER-2的评分等级及阳性表达均呈正相关，EGFR在HER-2过表达型与三阴型乳腺癌组织中显著升高，为研究HER-2阳性乳腺癌及三阴型乳腺癌的靶向药物治疗提供线索及理论依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集2015年1月—2020年3月邯郸市中心医院住院行乳腺癌根治切除术或乳腺癌单切术标本650例，病例筛选纳入标准：女性患者；患者临床资料、病理诊断结果、免疫组化检测结果、随访治疗完整；术前未进行放疗、化疗、内分泌等任何治疗。排除标准：男性患者；临床资料不完整；未行免疫组化检测；HER-2评分可疑阳性未进一步行FISH检测。650例乳腺癌患者中，IDC 600例，浸润性小叶癌50例。对照病例选取同期手术切除的乳腺纤维腺瘤的标本30例，要求肿物完整切除不伴有其他乳腺疾病，患者资料完整。患者或家属同意参与研究并签署知情同意书。本次研究得到邯郸市中心医院伦理委员会批准。

1.2 方 法

所有标本经4%中性福尔马林固定18～24 h，常规石蜡包埋，切片4μm厚，苏木精-伊红染色法(HE染色)。采用SP法行免疫组织化学检测，一抗EGFR、HER-2、雌激素(estrogen，ER)、孕激素(progesterone，PR)、增殖指数(Ki67)均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 免疫组织化学分析及结果评价

1.3.1 HER-2蛋白采用DAKO Hercept Test评分系统评价HER-2蛋白表达水平，表达于细胞膜，评级为(0)～(3+)。阴性(0)：无染色或≤10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱细胞膜染色；(1+)：＞10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色。可疑阳性(2+)：＞10%浸润癌细胞呈现弱至中等强度的、完整细胞膜染色或≤10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染；阳性(3+)：＞10%的浸润癌细胞呈强、完整、均匀的细胞膜染色。

1.3.2 EGFR蛋白根据阳性细胞数量及着色程度进行半定量分析，EGFR主要定位于细胞膜，阳性细胞数量：阳性细胞数＜1%，计0分；1%≤阳性细胞数≤30%，计1分；30%＜阳性细胞数≤70%，计2分；70%＜阳性细胞数≤100%，计3分；着色程度：0分为不着色；1分为浅棕色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。两项分数累计相加：＜3分为阴性(-)，≥3分为阳性(+)[5]。ER、PR、Ki67均定位于细胞核，阳性细胞数与肿瘤细胞数的比例即为阳性率(%)。

1.4 荧光原位杂交检测HER-2基因扩增情况

免疫组化染色HER-2可疑阳性的病例需进一步行荧光原位杂交(fluorescentin situhybridization，FISH)检测明确HER-2基因是否扩增。在肿瘤区域清晰处，计数至少20个细胞核内GSP HER-2(红色)和CEPl7(绿色)信号。分别记录红色和绿色的信号总数，计算平均每个细胞GSP HER-2、CEPl7拷贝数及两者的比值。HER-2/CEPl7＜2.0，且平均GSP HER-2拷贝数/细胞数＜4.0，为HER-2阴性(无基因扩增)；HER-2/CEPl7＜2.0，且4.0≤平均HER-2拷贝数/细胞数＜6.0，为不确定HER-2基因是否扩增；HER-2阳性且HER-2/CEPl7≥2.0，或HER-2/CEPl7＜2.0而平均HER-2拷贝数/细胞数≥6，为HER-2基因扩增。

1.5 分子分型定义

按St.Gallen乳腺癌国际共识，依据ER、PR、HER-2、Ki67表达情况进行分型。Luminal A型：ER且PR阳性，HER-2阴性以及Ki67≤14%。Luminal B型：ER阳性，HER-2阴性以及Ki67＞14%，或Ki67中间型、PR阴性或低表达(＜20%)；ER阳性，HER-2阳性或扩增，任何Ki67或任何PR。HER-2过表达型：HER-2阳性或扩增，且ER与PR阴性。三阴型：ER、PR和HER-2均阴性。

1.6 统计学分析

采用SPSS 22.0软件对数据进行分析，计数资料以例数(n)或率(%)表示，组与组之间率的比较采用χ2检验，相关性分析采用Pearson积矩及Spearman秩相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR、HER-2蛋白在不同乳腺病变中的表达情况

本研究纳入IDC 600例，其中EGFR蛋白表达阳性292例(48.7%)；HER-2表达阳性167例(27.8%)，其中包括HER-2蛋白表达阳性149例、HER-2基因扩增18例。浸润性小叶癌50例，其中EGFR蛋白表达阳性12例(24.0%)，HER-2蛋白表达阳性4例(8.0%)。对照组乳腺纤维腺瘤30例，EGFR蛋白表达阳性5例(16.7%)，HER-2蛋白表达阳性2例(6.7%)。各组之间两两比较，EGFR、HER-2在IDC中表达阳性率显著高于浸润性小叶癌与纤维腺瘤(P＜0.05)，在浸润性小叶癌与纤维腺瘤中的差异无统计学意义(P＞0.05，见表1)。

表1 EGFR、HER-2在浸润性导管癌、浸润性小叶癌、纤维腺瘤中的表达情况

2.2 浸润性导管癌中EGFR、HER-2蛋白表达情况及其相关性

600例IDC中HER-2评分为0者58例(9.7%)，其中12例EGFR阳性(20.7%)；评分(1+)病例数261例(43.5%)，其中72例EGFR阳性(27.6%)；评分(2+)病例数132例(22.0%)，其中78例EGFR阳性(59.1%)；评分(3+)病例数149例(24.8%)，其中130例EGFR阳性(87.2%)。见图1。132例HER-2评分(2+)均进行FISH检测HER-2基因扩增情况，其中18例扩增阳性，检测阳性率为13.6%。见图2。EGFR阳性率随HER-2评分等级增高而逐渐升高，采用Spearman秩相关分析，提示EGFR阳性率同HER-2评分等级呈正相关(r=1.000，P＜0.05)。见表2。

图1 EGFR、HER-2蛋白免疫组织化学检测结果评价示例（SP法，×200）

图2 FISH检测显示HER-2基因扩增1 000倍

表2 600例IDC中EGFR、HER-2表达情况及其相关性

2.3 浸润性小叶癌中EGFR、HER-2蛋白表达情况及其相关性

50例浸润性小叶癌中HER-2评分为0者7例(14.0%)；评分(1+)的病例数为31例(62.0%)，其中5例FGER阳性(16.1%)；评分(2+)的病例数为8例(16.0%)，其中4例EGFR阳性(50.0%)；评分(3+)的病例数为4例(8.0%)，其中3例EGFR阳性(75.0%)。8例HER-2评分(2+)者中，FISH检侧HER-2基因扩增者0例。EGFR阳性率随HER-2评分等级增高而逐渐升高，采用Spearman秩相关分析，提示EGFR阳性率同HER-2评分等级呈正相关(r=1.000，P＜0.05)。见表3。

表3 50例浸润性小叶癌中EGFR、HER-2蛋白表达情况及其相关性

2.4 浸润性乳腺癌中EGFR、HER-2表达的相关性

650例浸润性乳腺癌中，EGFR蛋白表达阳性总数304例(46.8%)，HER-2蛋白表达阳性总数171例(26.3%)，171例HER-2蛋白表达阳性组中EGFR蛋白表达阳性151例，479例HER-2蛋白表达阴性组中EGFR蛋白表达阳性153例，采用Pearson积矩相关分析，提示EGFR蛋白表达与HER-2蛋白阳性表达呈正相关(r=0.209，P＜0.05)。

2.5 浸润性乳腺癌中各分子亚型中EGFR蛋白表达情况

依据ER、PR、HER-2及Ki-67的表达结果进行分子分型，650例浸润性乳腺癌中Luminal A型166例(25.5%)；Luminal B型总数290例(44.6%)，其中Luminal B(HER-2阴性)型221例(34.0%)，Luminal B(HER-2阳性)型69例(10.6%)；HER-2过表达型102例(15.7%)；三阴型92例(14.2%)。各组分别对应EGFR阳性数35例(21.1%)、110例(37.9%)、53例(24.0%)、57例(82.6%)、93例(91.2%)、66例(71.7%)。Luminal B型病例数明显多于其他3型，Luminal A型明显多于HER-2过表达型及三阴型，Luminal B(HER2阴性)型明显多于Luminal B(HER2阳性)型。EGFR阳性率在HER-2过表达型和三阴型中显著高于Luminal A型和Luminal B型，Luminal B型中HER-2阳性型明显高于HER-2阴性型(P＜0.01)，其他指标的组间差异无统计学意义。见表4。

表4 650例IBC各分子亚型分布情况及EGFR表达情况

3 讨论

EGFR是一种跨膜蛋白受体，由erbB1基因编码，其位于人第7号染色体短臂上(7p12)，全长约118 kb，由28个外显子组成。现有的研究表明EGFR相关信号通路在肺癌的发生和发展中起重要作用。EGFR酪氨酸激酶抑制剂是目前针对EGFR治疗非小细胞肺癌的重要分子靶向药。多项研究显示EGFR在结直肠癌、鼻咽癌、子宫内膜样腺癌、胆管癌等多种恶性肿瘤中高表达，参与了肿瘤血管的生成、转移、黏附，并抑制了细胞凋亡等过程，并且与患者的预后和总生存期密切相关[5-6]。一项研究结直肠癌CAR-T细胞治疗相关肿瘤靶点的筛选中，发现CAR-T细胞可以大量杀死EGFR阳性的肿瘤细胞，认为EGFR为CAR-T细胞免疫疗法的靶点[7]。以EGFR为靶点治疗肿瘤的研究越来越多。宋欣等[8]采用免疫组化与荧光原位杂交技术研究发现，EGFR和HER-2在肺癌和乳腺癌中的蛋白表达与基因扩增具有同样的变化趋势，EGFR和HER-2蛋白表达与基因扩增之间均存在正相关性。由此，我们通过EGFR、HER-2免疫组化检测结果阳性来判断存在基因扩增的可能性大。我们的研究数据显示EGFR在IDC中表达明显高于浸润性小叶癌及乳腺纤维腺瘤，提示EGFR的高表达与IDC的发生、发展有关。这为我们将来研究针对EGFR为靶点治疗乳腺癌提供了线索。

2011年的研究统计138例乳腺癌，其中EGFR表达与HER-2表达呈负相关[9]，而本研究统计的650例乳腺癌数据中显示EGFR的表达随着HER-2的表达强度增加而升高，且EGFR的表达阳性率与HER-2阳性表达呈正相关。HER-2与ERFG同属于酪氨酸激酶受体家族成员，具有高度同源性。至今未找到HER-2的特异性配体，在其它家族成员的配基作用下，可与同家族成员EGFR结合形成同源性二聚体，引起HER-2羧基末端酪氨酸残基磷酸化，之后，激活其下游信号转导Ras-Raf-MEK-MAPK通路与PI3K-Akt激酶通路，从而参与肿瘤细胞的增殖、分化、迁移、黏附、转化、存活、凋亡等过程[10]。另有研究显示HER-2可阻断EGFR的内化降解，致使EGFR表达水平升高[11]。这些理论可以解释本研究的结果，且已有研究报道呈现与本实验相同的结果[12]。杨悦等[13]研究EGFR、HER-2在结直肠癌组织中的表达及临床意义时，发现EGFR阳性组中HER-2阳性率明显高于EGFR阴性组，提示二者在结直肠癌中有共表达现象。在胃癌的研究中亦是如此[14]。目前，针对HER-2靶点的乳腺癌药物曲妥珠单抗在临床中取得了一定成效，成为HER-2阳性乳腺癌患者首选靶向药物，尽管如此，临床上出现曲妥珠单抗耐药，导致部分患者的治疗无效，普遍耐药性成为临床靶向治疗的巨大挑战，因此研究联合用药的成为新需求。早有报道，HER-2/EGFR双受体酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼可以在体内外抑制肿瘤细胞活性，且临床研究显示，可以治疗侵袭、复发、炎性、脑转移的乳腺癌，并展望拉帕替尼能成为HER-2过表达乳腺癌的一线辅助或解救治疗药物，同时拉帕替尼治疗其他实体肿瘤的临床试验也在大规模的开展，不断报道拉帕替尼在临床中取得了较好的疗效[15]。在研究HER-2/EGFR双重抑制作用的小分子抑制剂时，发现同时针对HER-2和EGFR两个靶点，可以抑制多条细胞信号传导通路，避免单一信号通路抑制的代偿，从而降低耐药性和不良反应，进一步构建了一种靶向HER-2/EGFR分子双特异性单链抗体，并在体内外抑制乳腺癌肿瘤细胞的活性和增殖[16]。

我们统计的650例浸润性乳腺癌中Luminal A型166例(25.5%)；Luminal B型总数290例(44.6%)，其中Luminal B(HER-2阴性)型221例(34.0%)，Luminal B(HER-2阳性)型69例(10.6%)；HER-2过表达型102例(15.7%)；三阴型92例(14.2%)。实验结果与Ishitha等[17]的研究结果相比，Luminal B(HER-2阴性)型比例偏高，三阴型略偏低，Luminal A型、Luminal B(HER-2阳性)型、HER-2过表达型比例基本保持一致。乳腺癌在不同区域，其分子亚型可以出现差异[2]。EGFR在HER-2过表达型、Luminal B(HER-2阳性)的阳性率显著高于Luminal A型及Luminal B(HER-2阴性)，这可以用EGFR表达与HER-2表达呈正相关来解释。EGFR阳性率在HER-2过表达型和三阴型中显著高于Luminal A型和Luminal B型，这同李星枝等[18]的研究结果保持一致。三阴型乳腺癌具有非常特殊的生物学行为和临床病理特征，被认为是一种独立的临床病理类型，侵袭性强，预后差，由于ER、PR、HER-2均为阴性，因此难以从内分泌治疗中获益，同时对常规化疗不敏感，HER-2靶向药物治疗无效，寻找其有效的治疗方案是近几年研究的热点之一。EGFR靶向药物的研究及在临床治疗多种肿瘤中取得一定疗效，其成为我们关注的热点[19-20]。EGFR在三阴型乳腺癌中阳性率显著升高，提示EGFR靶向药物治疗三阴型乳腺患者的可能性。

综上所述，EGFR在浸润性乳腺癌中表达阳性率升高，且与HER-2表达呈正相关，在HER-2过表达型，三阴型乳腺癌中的高表达，为我们研究HER-2/EGFR双重抑制剂治疗HER-2阳性乳腺癌及EGRF靶向药物治疗三阴型乳腺癌的可能性提供了线索和依据。