气相色谱-串联质谱法测定茶叶中嘧菌酯残留量的不确定度评定

陈秀宽 顾静 梁少东 张铨

摘 要：目的：评定气相色谱-串联质谱法测定茶叶中嘧菌酯残留量的不确定度。方法：建立不確定度评定的数学模型，对测量结果的每个不确定度来源进行分析和评定。结果：茶叶中嘧菌酯残留量为0.100 mg/kg，其扩展不确定度为0.005 mg/kg（P=95%，k=2）。结论：加标回收率和标准工作溶液配制引入的不确定度分量是影响嘧菌酯残留量不确定度的主要来源。

关键词：气相色谱-串联质谱;嘧菌酯;不确定度;茶叶

Uncertainty Evaluation for the Determination of Azoxystrobin Residues in Tea by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHEN Xiukuan， GU Jing， LIANG Shaodong*， ZHANG Quan

（Beihai Food and Drug Inspection Institute， Beihai 536000， China）

Abstract： Objective： To evaluate the uncertainty for the determination of azoxystrobin residues in tea by gas chromatography-tandem mass spectrometry（GC-MS/MS）. Methods： A mathematical model was established，and each component of uncertainty was calculated and evaluated. Results： When the azoxystrobin residues content in tea was 0.100 mg/kg， the expanded uncertainty was 0.005 mg/kg（P=95%，k=2）. Conclusion： The recovery of standard addition and the uncertainty components introduced by the preparation of standard working solutions are the main sources of uncertainty of residual azoxystrobin.

Keywords： Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry ; azoxystrobin; uncertainty; tea

嘧菌酯属于甲氧基丙烯酸类杀菌剂，因其具有高效、低毒的特点，其使用量在全球逐渐增长[1-2]，且在我国茶叶种植中也有使用。日本肯定列表制度中嘧菌酯在茶叶中的最大允许残留量为10 mg/kg，欧盟在茶叶中嘧菌酯的最大允许残留量则更为严格，为0.1 mg/kg。而我国现行国标中，对茶叶中嘧菌酯的最大允许残留量却没有规定[3]。目前我国气质联用法检测茶叶的现行国标中[4-5]，其检测的农药并不包括嘧菌酯。因此，参照国标《食品国家安全标准 植物源性食品中208种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法》（GB 23200.113—2018）、《测定不确定度的评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[6]和《化学分析中不确定度的评估指南》CNAS—CL006：2019[7]，建立了一种利用QuEChERS净化技术，快速测定茶叶中嘧菌酯的方法，并对其进行不确定度评定，为评价测量结果的可靠性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用茶叶均于本地超市随机购买。

1.2 试剂

乙腈，购自美国Fiher公司;乙酸，购自上海安谱公司;嘧菌酯（100 mg/L，1.2 mL）标准物质，购自坛墨质检科技股份有限公司;水为娃哈哈纯净水。

1.3 仪器

TQ-8040NX气相色谱-串联质谱仪，日本岛津公司;XSE205电子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司;Thermo scientific ST40R高速冷冻离心机。

1.4 试验方法

1.4.1 标准溶液的配制

取嘧菌酯标准物质（100 mg/L，1.2 mL）1.0 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成浓度为10 mg/L的标准中间液。取适量嘧菌酯标准中间液，用空白基质溶液稀释，配制成0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L和0.20 mg/L系列标准工作液。基质混合标准溶液应现用现配。

1.4.2 样品处理

称取2.00 g试样于50 mL塑料离心管中，加10 mL水涡旋混匀，静置10 min。加入10 mL乙腈-乙酸（99∶1），6 g无水硫酸镁、1.5 g醋酸钠及1颗陶瓷均质子，剧烈振荡1 min，4 200 r/min离心5 min。

吸取8 mL上清液加到含1.2 g硫酸镁、400 mg PSA、400 mg C18及400 mg GCB的塑料离心管中，涡旋混匀1 min。4 200 r/min离心5 min，取上清液过0.22 µm微孔滤膜，上气相色谱-串联质谱仪测试。

1.4.3 仪器条件

（1）色谱条件。SH-Rxi-5Sil MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）;进样口温度280 ℃;载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min;恒流模式;不分流进样;进样量1 µL;色谱柱温度：初始温度100 ℃，以30 ℃/min升至200 ℃，10 ℃/min升至300 ℃，保持10 min。

（2）质谱条件。将嘧菌酯进行全扫描，确定母离子，再给予一定的碰撞能量，扫描二级子离子，选取丰度较高的2个子离子分别为定量离子对和定性离子对，最后以MRM模式优化最佳碰撞能量。优化后的质谱参数及保留时间：嘧菌酯的定量离子对344.1→329.1，碰撞电压16 V，定性离子对344.1→171.1，碰撞电压40 V，保留时间15.625 min。

1.4.4 数学模型的建立

嘧菌酯含量计算公式为：

（1）

式中：X为试样中被测物残留量，mg/kg;C为基质标准工作溶液中被测物的浓度，mg/L;V为定容体积，mL;m为试样质量，g。

2 结果与分析

2.1 不确定度的来源分析

根据数学模型，确定不确定度来源为样品测定重复性引入的不确定度和样品加标回收引入的不确定度（A类评定）;样品称量引入的不确定度、标准工作溶液浓度引入的不确定度（包括标准溶液纯度、标准工作溶液配制过程、不同量程的移液器引入的不确定度、标准工作曲线拟合引入的不确定度）、前处理提取溶液体积引入的不确定度（B类评定）。由于温度影响和溶剂膨胀系数的数值很小，其引入的不确定度对结果评定不影响，故不考虑温度因素和溶剂膨胀系数因素引入的不确定度。

2.2 不确定度分量的评定与计算

2.2.1 A类不确定度的评定

（1）样品测定重复性引入的不确定度Urel（R1）。在重复性测定条件下，对加标样品（0.1 mg/kg）平行测定6次，嘧菌酯的加标回收结果为0.091 0 mg/kg、0.089 9 mg/kg、0.093 0 mg/kg、0.089 5 mg/kg、0.089 0 mg/kg和0.092 3 mg/kg，平均值为0.091 mg/kg，按照贝塞尔公式计算标准偏差为0.160 4%，其相对标准不确定度为：

Urel

（2）样品加标回收引入的不确定度Urel（R2）。按照欧盟嘧菌酯最大允许残留量，在6份茶叶样品中添加0.1 mg/kg嘧菌酯，嘧菌酯的回收率分别为90.80%、89.40%、96.10%、89.50%、88.45%和91.75%，平均回收率为91.0%，测得嘧菌酯平均含量为0.091 mg/kg。

按照贝塞尔公式计算标准偏差为2.75%。標准不确定度为，相对标准不确定度为

用t分布来检验平均回收率是否与1.0有显著性差异，经查表得知，在95%置信度，n=6，临界值为2.57。如果平均回收率≥2.57，则说明有显著差异。反之，则没有显著差异。检测统计数据，得到。t值结果大于2.57，平均回收率与1.0有显著差异，故需要按平均回收率修正结果，修正后嘧菌酯含量为0.100 mg/kg。

综合所有A类各个分量分析评定，合成A类相对不确定度为：

2.2.2 B类不确定度评定

（1）样品称量引入的不确定度 Urel（m）

天平校准证书规定，精密为0.000 1 g天平最大允许误差为±0.5 mg，按均匀分布估算，。由样品称量引入的相对不确定度为：

（2）标准工作溶液浓度引入的不确定度Urel（C）

（a）标准溶液纯度引入的不确定度Urel（Ca）。根据使用的嘧菌酯标准溶液（100 µg/mL）证书得知，其扩展不确定度为3%，k=2。则。

（b）标准工作溶液配制过程引入的不确定度Urel（Cb）。标准中间液（10 µg/mL）由标准储备液（100 µg/mL）稀释10倍配制，即准确吸取1.0 mL储备液于10 mL容量瓶，乙腈定容到刻度。依据JJG 196—2006[8]，1 mL单标线A级吸量管容量误差为±0.007 mL，以均匀分布估算，其引入的相对不确定度为：

依据JJG 196—2006，10 mL A级容量瓶容量误差为±0.020 mL，以均匀分布估算，其引入的不确定度为：

标准溶液配制过程引入的相对不确定度为：

（c）使用不同量程的移液器引入的不确定度Urel（Cc）。

使用上述标准中间液（10 µg/mL）配制嘧菌酯浓度为0.01 µg/mL、0.02 µg/mL、0.05 µg/mL、0.10 µg/mL和0.20 µg/mL的标准系列溶液。使用移液器为200 µL、100 µL、20 µL移液枪，容量瓶10 mL。根据移液枪检定证书，不同检定点的允许误差，按照均匀分布估算，计算出移液器不同吸取体积的不确定度，见表2。

其中，10 mL容量瓶使用了5次，200 µL移液枪200 µL量程，100µL量程各使用了一次，100 µL移液枪100 µL量程使用了1次，20 µL移液枪20 µL量程，10 µL量程各使用了1次，2次。因此，使用不同量程的移液器引入的相对标准不确定度为：

（d）标准工作曲线拟合引入的不确定度Urel（Cd）。对5个浓度水平嘧菌酯标准工作液，用最小二乘法进行拟合。用拟合后的校准曲线，对加标样品平行测定6次，结果见表3。因此由标准工作曲线拟合引入的相对不确定度见式（2）：

（2）

式中：Urel（Cd）为曲线拟合引入的相对不确定度;S（A）为拟合曲线的标准偏差;b为曲线斜率;p为样品测定次数，p=6;n为标准溶液测定次数，n=5;

C为标准系列浓度，µg/mL;C0为待测样品浓度平均值，0.018 2 mg/L;C为标准系列浓度平均值，0.076 mg/L。其中S（A）可按公式（3）计算：

（3）

式中：S（A）为拟合曲线的标准偏差;n为标准溶液测定次数，n=5;A为标准溶液仪器理论响应值;Ai为标准溶液仪器实际响应值。

由标准工作曲线拟合引入的不确定度由公式2计算，Urel（Cd）=0.003 4。

综上所述，由标准工作溶液引入的相对不确定度为：

（3）前处理提取溶液体积引入的不确定度Urel（V）

提取液10 mL，用10 mL单标线吸量管（A级）移取，根据JJG 196—2006，10 mL单标线A级吸量管容量误差为±0.02 mL，以均匀分布估算，其引入的相对不确定度为：

综上所有B类各个分量的分析评定，合成B类相对不确定度为：

2.3 合成不确定度

将A类评定Urel（A）和B类评定Urel（B）进行合成，即得茶叶中嘧菌酯测定的相对合成不确定度为：

2.4 扩展不确定度的合成

假设测量结果符合正态分布，在置信区间为95%时，选择包含因子k=2，则扩展不确定度为

2.5 测量结果不确定度的表示

根据JJF 1059.1—2012的规定，茶叶中嘧菌酯的含量结果为（0.100±0.005）mg/kg，k=2。

3 结论

通过评定可知，测量结果不确定度最大的来源为加标回收率和标准工作溶液配制引入的不确定度。因此，在试验过程中，尽可能减少提取净化步骤，提高样品回收率，使用更高纯度的标准物质和精密度更高的移液用具，可减少不确定度的引入，使结果更加准确、可靠。

参考文献

[1]张一宾.甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的全球市场概况及进展[J].世界农药，2016，38（4）：30-34.

[2]柏亚罗.嘧菌酯、吡唑醚菌酯等六大产品以绝对优势统领甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂市场[J].山东农药信息，2018（5）：23-28.

[3]国家卫生健康委员会，农业农村部，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量：GB 2763—2019[S].北京：中国标准出版社，2019.

[4]国家卫生健康委员会，农业农村部，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 植物源性食品中208种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法：GB 23200.113—2018[S].北京：中国标准出版社，2018.

[5]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.茶叶中519种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法：GB/T 23204—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.

[6]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.测量不确定度的评定与表示：JJF 1059.1—2012[S].北京：中国标准出版社，2012.

[7]中国合格评定国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南： CNAS—  CL006：2019[EB/OL].（2019-04-09）[2022-01-03].https：//www.cnas.org.cn/rkgf/sysrk/rkzn/2019/04/896487.shtml.

[8]国家质量监督检验检疫总局.常用玻璃量器检定規程：JJG 196—2006[S].北京：中国计量出版社，2006.

通信作者：梁少东（1982—），男，广西北海人，本科，工程师。研究方向：食品安全分析。E-mail：34697171@qq.com。