凤型大曲培曲阶段不同部位理化指标动态变化及微生物群落演替规律分析

张 艳，孟勤燕，杨美媛，白莉圆，徐 晨，张永利，闫宗科

（陕西西凤酒股份有限公司，陕西 凤翔 721406）

中国白酒以其悠久的酿造历史和独特的酿造工艺形成了多个独一无二的中国蒸馏酒品牌，因原料种类、工艺特点、主体香型等的不同被分为浓香型、凤香型、酱香型、清香型、芝麻香型等品类。中国名优白酒都是开放式自然发酵[1]，通过自然富集筛选环境中的微生物而制得的大曲是白酒酿造中复杂微生物菌群的重要来源，作为白酒生产关键的糖化剂、发酵剂、生香剂，对出酒率及基酒的质量直接发挥影响作用[2-3]。浓香型白酒[4]、清香型白酒[5]、酱香型白酒[6]等在大曲理化功能、微生物体系、大曲与白酒风味间的关联关系等方面已做了大量研究，全面了解了大曲培曲过程中各项指标变化规律，直接或间接证明了大曲在白酒生产过程中的关键作用。然而目前对凤型大曲培曲过程中各理化指标与微生物动态变化更替之间的关系并不明了。因此，了解凤型大曲培养过程中微生物群落结构演替规律，进而关联到大曲的物理、化学指标，摸索微生物与曲质量之间的关系尤为重要。本研究将对凤型大曲培曲过程进行全程跟踪，全面了解其理化指标变化和微生物菌群结构变化规律，为凤型大曲生产工艺调整和质量评判标准提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

凤型大曲：选择2019 年8 月下旬入房的38#、64#两房大曲进行跟踪研究。

试剂：三羟甲基氨基甲烷、酒石酸钾钠、三氯乙酸、乳酸、干酪素、己酸、丙酸辛酯等均为分析纯。

仪器设备：冷冻高速离心机DH-2000R，上海德洋意邦仪器有限公司；紫外可见分光光度计TU-1810S，北京普析通用仪器有限责任公司；生化培养箱SPX-250-Ⅱ，上海龙跃仪器设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司；恒温水浴锅SYG-2S，常州朗越仪器制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 取样

以0 d（入房）、2 d、6 d、10 d、14 d、18 d、22 d、28 d（出房）共8个时间点取样，选择靠近门、窗和中间三个位置作为取样点，取曲块外围3 cm 样品粉碎后作为曲皮样，曲块中心3 cm 半径内样品粉碎后作为曲心样，具体取样范围如图1 所示。采用四分法取样，-20 ℃冷藏备用。

图1 大曲取样位点示意图

1.2.2 理化指标检测

温度：将温度计直接插入曲块中心测量曲心温度。

其他指标检测：水分、酸度、淀粉、糖化力、发酵力、液化力、酯化力测定，参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》。

1.2.3 微生物群落多样性检测

大曲样品送至上海派森诺生物科技有限公司进行高通量测序分析。

2 结果与分析

2.1 理化指标分析

2.1.1 曲心温度变化规律

制曲温度不同，产生的高级醇、醛类、酚类等风味物质种类也会有所不同，进而影响白酒风格[7-8]。从图2 可知，大曲发酵时曲心温度整体表现为前缓中挺后缓落，从第8 天以后进入大火期，维持4 d 左右，而后进入后火期，温度逐渐降低，第18 天降至26 ℃，直至出房曲心温度只是小幅波动。图3 中64#房大曲曲心温度变化趋势和38#房相似。

图2 38#房曲心温度变化

图3 64#房曲心温度变化

2.1.2 水分变化规律

水在微生物代谢活动中是不可或缺的营养要素，大曲中水分的变化影响着微生物生长代谢和相关功能酶系的合成[9]。从图4、图5 可看出，38#曲房和64#曲房曲皮曲心水分变化基本一致。发酵前期至大火期曲皮水分迅速降低，大火期后直至出房水分变化不大；发酵初期曲心水分短暂上升后迅速降低，大火期后水分依旧降低，但速率明显下降；整个发酵过程中水分由外向里逐渐扩散，曲心始终高于曲皮。

图4 38#房曲皮曲心水分变化

图5 64#房曲皮曲心水分变化

2.1.3 淀粉含量变化规律

淀粉是大曲培养过程中微生物生长繁殖、新陈代谢的重要营养物质，大曲中淀粉含量变化在一定程度上反映了微生物对淀粉的利用情况[10]。从图6、图7 可看出，发酵前期，微生物大量繁殖，曲皮曲心中淀粉被快速利用，但淀粉消耗速率有所差异。入房时强化菌液（霉菌、酵母菌的强化功能菌稀释液）仅喷洒于曲皮，加之曲皮与空气直接接触，入房后曲皮微生物大量繁殖造成淀粉含量明显下降；而曲心因内部供氧不足，微生物生长缓慢，淀粉利用速率较低。进入大火期后，高温使曲皮曲心中大量微生物死亡，仅有耐高温的得以存活，淀粉含量基本保持不变；收火后，品温下降，部分细菌芽孢和霉菌的孢子开始逐渐萌发；直至后期，随着温度下降至室温，细菌、酵母、霉菌、放线菌等微生物开始生长繁殖，但由于后期大曲中水分含量较少，微生物生长受限，淀粉含量变化不明显。

图6 38#房曲皮曲心淀粉含量变化

图7 64#房曲皮曲心淀粉含量变化

图8 38#房曲皮曲心酸度变化

图9 64#房曲皮曲心酸度变化

大曲酸度形成来源于两方面，一是生酸微生物代谢生成有机酸，二是微生物通过TCA 循环降解蛋白质、脂肪和淀粉形成各种酸类物质[11]。适当的发酵酸度，既能抑制病原菌和腐败微生物，又能保证功能微生物的生长、糖化和发酵[12]。64#房大曲入房培养的第2～6 天曲皮酸度处于较高水平，主要原因是乳酸菌（丰度占比为51.75%～68.6%）大量繁殖代谢产生有机酸，发酵前期38#房大曲曲皮曲心酸度较高也是乳酸菌造成的。两房大曲曲皮酸度在发酵初期迅速升高，大火期间随着微生物大量消亡又迅速下降，而后曲皮酸度波动变化，曲心趋于稳定，主要是曲皮微生物在后期能继续繁殖，曲心微生物生长受限所致。

2.1.5 糖化力变化规律

图10 38#房曲皮曲心糖化力变化

图11 64#房曲皮曲心糖化力变化

糖化力是糖化型淀粉酶将淀粉糖化生成葡萄糖的过程，其活力的高低直接关系到酿酒过程中淀粉的转化率[13]。大曲入房时曲皮糖化力高达612 U，主要是因为大曲为生料发酵，大麦小麦豌豆自身就含有一定量的糖化酶。但原料中的糖化力易受温度影响，不够稳定[14]。入房前2天曲温逐步上升，原料自身的糖化力下降，霉菌在曲皮表面大量繁殖，但尚未产生一定量的糖化酶[15]，所以糖化力有所下降。曲心霉菌在发酵前期较少且生长缓慢，原料中的糖化力不稳定，导致曲心糖化力出现大幅下降。随着培养时间的延长，品温升高，曲皮表面水分迅速散失，不利于霉菌的生长代谢，导致曲皮糖化力出现一定幅度的下降；曲心温度虽不断升高，但由于曲心内部水分依旧高于20 %，嗜热子囊菌继续生长代谢产生β-葡聚糖酶[16]，致使糖化力出现升高现象。发酵后期，曲皮环境依旧不利于霉菌的生长，糖化力呈下降态势，进入晾架期后，少数耐干燥的微生物尚能发育，曲皮糖化力再次回升。由于发酵后期曲心水分不断下降，环境恶劣，大部分微生物停止生长，直至出房，曲心糖化力处于较低水平。

2.1.6 发酵力变化规律

图12 38#房曲皮曲心发酵力变化

图13 64#房曲皮曲心发酵力变化

发酵力是大曲中酶系将糖类发酵后生成二氧化碳和酒精强弱的评价，主要受酵母菌影响[17]。在整个发酵阶段，两房大曲曲皮与曲心发酵力变化趋势基本一致。入房时曲心发酵力主要与大曲原料本身含有的酵母菌有关，曲皮发酵力与大曲原粮、曲房微生物环境以及喷洒强化菌种有关。发酵前期，曲块温度适宜，水分氧气充足，酵母菌等微生物大量繁殖，曲皮、曲心发酵力迅速升高。随后曲心温度逐渐升高，酵母活力下降，曲心发酵力迅速下降，进入大火期，曲心发酵力降至最低；曲皮升温幅度较曲心小，对酵母菌影响不剧烈，发酵力出现小幅度下降。发酵后期，虽然曲心温度和室温逐渐降低，但由于曲块整体含水量较低，不适宜酵母菌大量繁殖，导致发酵力波动变化且处于较低水平。从整个发酵过程来看，曲皮发酵力略高于曲心发酵力。

2.1.7 酯化力变化规律

图14 38#房曲皮曲心酯化力变化

图15 64#房曲皮曲心酯化力变化

酯化力是大曲发酵后形成的催化生酯的能力。从培曲过程来看，曲皮曲心酯化力变化规律基本一致。发酵前期，霉菌、酵母菌大量增殖，此时曲皮与曲心酯化力处于较低水平，进入潮火期后细菌代谢酶系增强，酯化力迅速升高，且38#房升高幅度大于64#房。两房曲酯化力在第18 天左右达到最大，而后略微降低逐渐趋于平稳，直至出房，酯化力无较大变化，后期曲心酯化力高于曲皮。

2.2 凤型大曲培曲阶段微生物群落结构演替规律分析

2.2.1 真菌

水利建设工程由施工准备开始到竣工交付使用，要经过若干工序、工种的配合施工，而工程质量的形成不仅取决于原材料、构配件，同时也取决于各工种、工序的作业质量。为了实现对工程全方位、全过程的质量控制，按工程的形成过程，考虑设计的布局、施工布置等因素，将水利建设工程依次分为单位工程、分部工程、单元工程。项目划分贯穿于工程建设的始终。

2.2.1.1 Alpha 多样性分析

(1)培曲大曲中真菌的Alpha多样性指数

通过Illumina高通量测序对酒醅发酵过程中的8 个样本进行真菌多样性分析，在97%相似度水平下对序列聚类并对OTU划分，结果如下。

Alpha 多样性是指一个特定环境或生态系统内的多样性，主要用来反映单个样品的物种多样性、丰富度以及均匀度。表1中coverage是所有样本序列的覆盖率，其数值在0.999838～0.999999 之间，表明本次测序结果能完整反映培曲阶段大曲中真菌菌群组成的真实情况。Chao1 和Observed_species 指数主要表征样本中物种丰富度，其数值越大，表明样本中包含物种的数目越多；Shannon 和simpson 指数主要表征样本中物种多样性，值越高表明样本的多样性越高[18-19]。

表1 培曲大曲中真菌的Alpha多样性指数

由表1 可知，凤型大曲培曲阶段曲皮和曲心中真菌多样性和丰富度随着培曲时间的变化呈现不同的变化规律。入房大曲曲皮（Q0P）中真菌丰富度和多样性明显高于后期培曲阶段，这是因为入房大曲中混入大量来自原料、环境、水中的真菌，使得曲块中真菌丰富度和多样性高；培曲的2～10 d 曲皮霉菌和酵母菌大量繁殖，曲块温度迅速上升，酸度也快速升高，此时部分不耐酸不耐热的微生物大量衰亡或受到抑制，真菌多样性和丰富度降低；培曲10 d 以后，霉菌和酵母菌增殖缓慢，大部分酵母菌衰亡，曲块温度和酸度逐渐降低后趋于稳定，部分细菌开始增殖，曲块中微生物结构在经历环境的淘汰选择后逐渐平稳，因此曲块中真菌群落多样性和丰富度在培曲的后期相对稳定。入房时曲心微生物多样性低于曲皮，主要因为曲皮表面喷洒了强化菌液且大量接触环境，表明了环境微生物对大曲培养的重要作用；培曲前期曲心水分流失速度较缓，酸度上升幅度小，真菌种群丰富度和多样性要高于曲皮；后期由于曲心内部温度较高，含氧量不足等原因使得曲心真菌的微生物多样性又低于曲皮。出房混合样的真菌多样性和丰富度要高于曲皮和曲心，这可能是因为曲皮和曲心样本只能代表大曲曲块表皮和最中心部位，而曲皮和曲心的中间过渡部位中微生物多样性丰富。

(2)稀疏曲线

图16 为凤型大曲培曲阶段真菌群落稀疏曲线，横坐标为测序深度，纵坐标为OTU 数。曲线的平缓程度反映了测序深度对观测样本多样性影响程度，通过稀疏曲线可以在相同测序深度下比较不同样本中OTU 数量的多少，进而衡量每个样本中物种多样性高低[20]。由图16 可知，测序深度在10000 以后样本中0TU 数量增加趋势平缓，稀疏曲线都已进入平台期，表明测序深度合理，结果真实可靠。图17 中入房大曲曲皮和曲心中真菌群落多样性最高。

图16 培曲大曲中真菌稀疏曲线

图17 培曲大曲中属水平真菌组成分布

2.2.1.2 物种分类学分析

大曲作为多菌种微生态制品，其所含微生物的种类和数量直接影响着白酒的产质量和风格特征[21]。从图17 可看出，曲坯入房时真菌种类较多，第0 天曲皮与曲心在种群丰富度及占比关系上存在一定差异，曲皮以伊萨酵母属（Issatchenkia）、链格孢属（Alternaria）和威克汉姆酵母属（Wicherhamomyces）为主，曲心以伊萨酵母属、链格孢属和毕赤酵母属（Pichia）为主。两者之间的差异主要由于曲坯入房后会在曲皮表面喷洒强化菌液，菌液难以立即渗入曲心。经过上霉阶段，曲皮以伊萨酵母属和毕赤酵母属为主，曲心以伊萨酵母属和哈萨克斯坦酵母属（Kazachstania）为主。第6 天，曲皮曲心主要以伊萨酵母属为主。温度持续升高，大火期时，由于曲心温度达到60 ℃，耐高温的嗜热子囊菌属（Thermoascus）占主导地位，而曲皮较曲心升温速度慢，此时依旧以伊萨酵母属为主，但嗜热子囊菌属所占比例逐渐升高。大火期结束时，曲心除嗜热子囊菌属外，其他真菌基本死亡，此时曲皮除了伊萨酵母属和嗜热子囊菌属外，还有一定量的根霉（Rhizopus）。随后温度逐渐下降，其他真菌逐渐开始生长，曲皮曲心中嗜热子囊菌属相对丰度逐渐降低。从第22 天直至出房，曲皮以伊萨酵母属和嗜热子囊菌属为主，还有一定量的曲霉属（Aspergillus），此时，曲心温度降至25 ℃左右，曲霉属生长条件较适宜，开始大量繁殖。从出房混合大曲样来看，其主要以嗜热子囊菌属、伊萨酵母属和曲霉属为主。从整个大曲发酵过程上来看，曲皮中优势菌种主要为伊萨酵母，曲心在大火期之前优势菌种为伊萨酵母，经过大火炼菌，嗜热子囊菌属成为优势菌种，在发酵后期，曲霉属开始大量繁殖，至大曲出房，曲心优势菌种为嗜热子囊菌属和曲霉属。嗜热子囊菌属、威克汉姆酵母属对大曲糖化力和液化力的提升有积极作用，根霉对提升大曲酯化力作用明显[22]。

2.2.1.3 物种组成热图

图18 为大曲培曲过程中真菌组成热图，红色越深表明物种丰度越大，蓝色越深表明物种丰度越小[23]。由图18可知，入房大曲的微生物组成与发酵期存在明显区别，0 d 时大曲曲皮曲心中真菌种类较多，发酵开始后，大曲中真菌多样性和丰富度迅速降低。入房曲坯中真菌种类繁多，来源于环境、原料、水等，发酵开始后，部分微生物因不适应曲房环境迅速衰亡，此时霉菌和酵母菌大量增殖；中后期随着曲坯品温升高，只有一些耐高温的细菌及少量霉菌存活，大曲培养阶段微生物菌群结构在与环境的淘汰和适应过程中逐渐稳定。

图18 培曲大曲中属水平真菌组成热图

2.2.2 细菌

2.2.2.1 Alpha 多样性分析

(1)培曲大曲中细菌的Alpha 多样性指数

通过Illumina高通量测序对酒醅发酵过程中的8 个样本进行细菌多样性分析。在97 %相似度水平下对序列聚类并对OTU划分，结果如下。

培曲阶段大曲中细菌群落多样性及丰富度随培养时间的不同有所变化。入房曲坯曲皮和曲心的Chao1 指数和Observed_species 指数都比较高，表明入房大曲中细菌多样性高，培养2 d 后由于霉菌、酵母菌的大量增殖，曲块酸度和温度上升，部分细菌因不适应环境而大量衰亡，多样性减小[24]。培养的6～18 d 是细菌大量繁殖时期，此时细菌菌落丰富度逐渐增大，种类增多；整体看大曲曲皮细菌多样性和丰富度要高于曲心。

表2 培曲大曲中细菌的Alpha 多样性指数

（2）稀疏曲线

图19 为培曲阶段大曲中细菌稀疏曲线，图中曲线逐渐趋于平坦，表明测序深度基本合理，足以代表所有样本信息。由图19 可以看出，同一测序深度下，曲皮微生物多样性要高于曲心。

图19 培曲大曲中细菌稀疏曲线

2.2.2.2 物种分类学分析

相对于大曲中真菌的物种组成，细菌更为复杂。曲坯刚入房时，曲皮曲心物种组成差别较小。经过上霉阶段，曲皮与曲心中罗斯伯里氏菌属（Romboutsia）相对丰度增大，曲心醋酸杆菌属（Acetobacter）相对丰度迅速提高，此时曲房内能够明显闻到酸味。大曲继续培养，毛螺菌科NK4A136（Lachnospiraceae NK4A136）群组继续繁殖，相对丰度继续提高。大火期，曲心中乳酸杆菌属（Lactobacillus）大量死亡，相对丰度明显降低，取而代之的为狭义的梭菌属（Clostridium sensu stricto）、贪铜菌属（Cupriavidus）和葡萄球菌属（Staphylococcus），其中梭菌属代谢生成的乙醇脱氢酶是参与乙醇生成的重要酶之一[25]。由于曲皮升温速度低于曲心，除罗斯伯里氏菌属相对丰度提高外，其他物种组成无明显变化。大火期结束时，曲心中耐高温的葡萄球菌属占绝对优势，此外还含有一定量的乳酸杆菌属和狭义的梭菌属等。曲皮乳酸杆菌相对丰度也明显降低，魏斯氏菌属（Weissella）明显提高。大曲后火期，曲皮中魏斯氏菌属相对丰度也处于较高水平。出房时，曲心中螺杆菌属（Helicobacter）占绝对优势，此外还含有大量的魏斯氏菌属、葡萄球菌属、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、乳酸杆菌属和短杆菌属（Brevibacterium）。曲皮中乳酸杆菌成为绝对优势菌种，此外还含有大量贪铜菌属、螺杆菌属、魏斯氏菌属、醋酸杆菌属和链霉菌属（Streptomyces）。出房混合大曲样中乳酸杆菌属为绝对优势菌种，此外还含有大量的魏斯氏菌属、毛螺菌科NK4A136群属和瘤胃梭菌属（Ruminococcus），出房混合样中细菌组成主要为杆菌属。

2.2.2.3 物种组成热图

大曲培曲过程中细菌结构组成对大曲酸度、酯化力等生化性能影响较大[26-27]。图21 为凤型大曲培曲过程中前20的细菌组成热图，红色代表该属在该样本中丰度较高，蓝色代表该属在该样本中丰度较低。热图组成可直观反映发酵周期与主要细菌的相关性大小。由图21 可知，大曲培养0～6 d 时，细菌结构组成较为相似，此时曲坯中细菌增殖缓慢，主要为霉菌和酵母菌的生长；培养6 d 之后大曲中细菌开始大量增殖，多样性增加，曲皮曲心细菌结构组成存在差异。

图20 培曲大曲中属水平细菌组成分布

图21 培曲大曲中属水平细菌组成热图

3 结论

本试验主要研究了凤型大曲培曲过程中理化指标变化和微生物群落结构演替规律。结果表明，培曲过程中大曲理化指标变化与微生物群落结构演替关系密切。曲心温度变化呈现“前缓中挺后缓落”趋势，主要是微生物生长代谢释放热量，同时微生物对水分的利用使得曲坯中水分含量持续降低，且曲皮始终低于曲心；微生物增殖对淀粉的利用率在10%左右，曲皮消耗速率高于曲心；前期伊萨酵母的大量增殖使得曲坯酸度迅速升高，中后期酵母菌大量消亡，酸度降低；培曲过程中随着微生物的消长，大曲糖化力、发酵力波动变化，曲皮整体高于曲心；酯化力在培曲的后期迅速升高，主要与后期细菌大量增殖有关。高通量测序结果显示培曲大曲中细菌物种丰富度和多样性大于真菌，曲皮细菌始终以Lactobacillus为主导，曲心优势细菌不同时期有所不同；曲皮真菌以Issatchenkia为主，曲心前期以Issatchenkia为主，后期Thermoascus迅速增殖成为优势菌；α-多样性进一步表明大曲培曲过程中不同时期、不同部位微生物丰富度和多样性存在差异。本文通过探究凤型大曲培曲过程中不同部位理化指标和微生物群落结构演替规律变化，为凤型大曲质量把控和品质提升奠定了理论基础，将进一步科学指导西凤酒的生产，提升其品质。