酒精发酵橘皮果渣中多糖提取工艺的优化研究

陈清婵，简清梅，孙爱红

(荆楚理工学院生物工程学院，湖北 荆门 448000)

柑橘是芸香科中柑橘属植物的水果，目前我国无论是柑橘种植面积还是柑橘的产量，都是世界上最大的国家。在我国柑橘产业中，柑橘汁占79 %，柑橘罐头占20 %。而且随着我国柑橘种植面积的不断扩大和柑橘果实加工迅速发展，导致产生了大量的柑橘皮及柑橘渣。目前，仅有少量柑橘皮作为药材利用，绝大多数柑橘皮作为废物丢弃或加工成动物饲料。直接丢弃或填埋处理会对环境造成严重污染，但加工饲料通常采用粉碎和干燥等处理，能耗大。柑橘皮果渣中有多种活性成分，主要包括多糖基成分（果胶、纤维素、半纤维素）、精油、黄酮、色素等，其含量甚至高于柑橘加工制成品，其中多糖含量较为可观。大量国内外研究资料表明，植物多糖具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗炎、抗病毒、降低血糖等多种生物活性。目前植物多糖的提取方法被普遍应用的是水提醇沉法。此外复合酶浸提法、超声波提取法、微波提取等不同提取方法与传统工艺相比更加高效、节能。这些提取方法能够在提高多糖产率及纯度的同时降低能耗。

本试验在利用柑橘皮果渣发酵获得橘子酒后，以发酵橘皮果渣为原料，利用微波辅助提取技术对其多糖进行提取，用响应曲面法优化提取工艺，旨在寻找一种途径来对柑橘皮果渣综合利用进行新尝试，为柑橘皮果渣再利用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：新鲜柑橘，湖北荆门漳河自产柑橘。

菌种：安琪酿酒酵母，湖北安琪酵母股份有限公司。

试剂及耗材：NaHSO、葡萄糖、苯酚，天津市福晨化学试剂厂，均为分析纯；浓硫酸、95%乙醇，武汉市洪山中南化工试剂有限公司，均为分析纯。

仪器设备：101-1 型鼓风干燥箱，北京科伟永兴仪器有限公司；WY200B 恒温摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；722N 可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；FA24C电子分析天平，上海衡际科学仪器有限公司；NH4 数显恒温水浴锅，上海力辰邦西仪器科技有限公司；JG手提式多功能粉碎机，上海广沙工贸有限公司；G70D20CSP-D2(SO) 微波炉，佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

酒精发酵橘皮果渣样品→加水浸泡→微波提取→离心→上清液加热浓缩→加入95%乙醇→4 ℃沉化12 h→离心→鼓风干燥→发酵橘皮果渣粗多糖

1.2.2 操作要点

（1）原料预处理。橘皮果渣经酒精发酵后得到橘子酒，离心取橘皮果渣，再干燥处理。得到颗粒状的发酵橘皮果渣，将其放入手提式多功能粉碎机内研磨，得到细粉状的发酵橘皮果渣。

（2）浸泡。用电子天平称取5.0 g 预处理的发酵橘皮果渣样品加入选定水料比的蒸馏水中浸泡12 h。

（3）微波提取。在微波炉中按照选定的微波功率、提取时间和水料比进行微波辅助提取多糖。

（4）离心和沉化。将提取液离心完后收集上清液。将上清夜减压浓缩，使体积浓缩至原来的1/3，然后加入浓缩液4 倍体积的95 %乙醇，放入冰箱内，使其在4 ℃温度下沉化24 h。

（5）离心和干燥。离心收集沉淀，干燥后得到发酵橘皮果渣粗多糖。

1.2.3 单因素试验

单因素试验取值见表1，单因素试验时选定的微波功率为420 W，提取时间为5 min，水料比20∶1。

表1 单因素试验设计

1.2.4 响应曲面优化试验

在单因素试验基础上，根据Box-Benhnken 中心组合试验设计来优化微波辅助提取发酵橘皮果渣多糖的工艺，选择微波功率（X）、提取时间（X）和水料比（X）3 个因素为影响因子，多糖提取率为响应值，响应面法分析试验因素及设计水平见表2。

表2 响应面试验设计因素水平表

1.2.5 测定方法

1.2.5.1 葡萄糖标准曲线的绘制

准确称取200 μg 干燥恒重的葡萄糖，配制成浓度为20 μg/L 的葡萄糖标准溶液，分别准确吸取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL 的葡萄糖标准溶液置于10 mL 试管中，而后分别用纯水滴加至2 mL，再加入1 mL质量分数为5%苯酚溶液和浓硫酸溶液5 mL，振荡混匀，将试管置于37 ℃水浴中静置30 min，而后立即冷却至室温，在波长490 nm 处测定其吸光度值。绘制标准曲线(纵坐标为490 nm处吸光度值，横坐标为葡萄糖浓度μg/L)，拟回归方程。得到回归方程：

式中：y——490 nm处吸光度值；

x——葡萄糖浓度，μg/L；

R——决定系数。

1.2.5.2 总糖含量测定

本实验采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准品，测定发酵橘皮果渣多糖的含量。精密称取粗多糖样品20 μg 溶解于1 L 容量瓶中，配制成浓度为20 μg/L 的样品溶液。准确吸取样品液1 mL，按1.2.5.1 步骤测定吸光度值，从葡萄糖标准曲线中求出样品中多糖的含量。计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 微波功率对多糖提取率的影响

由图1 可知，随着微波功率的增加，发酵橘皮果渣多糖提取率呈先上升后下降的趋势。当功率在280～350 W 之间，多糖得率呈现较快的增长趋势,但随着功率进一步上升，多糖得率增幅减小，在微波功率490 W 左右达到最大，此时多糖提取率为3.96 %，之后增加微波功率，多糖得率反而有所降低。这可能是微波功率达到一定强度后促使了发酵橘皮果渣多糖的降解。

图1 微波功率对多糖提取率的影响

2.1.2 提取时间对多糖提取率的影响

由图2 可知，随着微波提取时间的延长，发酵橘皮果渣多糖提取率逐渐上升，可以适当延长提取时间，有利于细胞内有效成分的释放。当提取时间在7 min 时，多糖提取率达到最大，此时多糖提取率为3.88%。继续延长时间，发酵橘皮果渣多糖提取率开始下降。这可能也是因为微波处理时间过长促使了发酵橘皮果渣多糖的降解。

图2 提取时间对多糖提取率的影响

2.1.3 水料比对多糖提取率的影响

从图3 可知，在微波辅助提取过程中，随着水料比的增大,发酵橘皮果渣多糖的提取率呈逐渐上升趋势。当水料比超过40∶1 时，发酵橘皮果渣多糖提取率增幅不明显。可见继续增加水料比值对进一步提高发酵橘皮果渣多糖提取率的意义不大，基于节约资源的出发点，最佳提取液料比选择40∶1，此时发酵橘皮果渣多糖提取率为5.07%。

图3 水料比对多糖提取率的影响

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 回归模型的建立

以微波功率X、提取时间X、水料比X为自变量，多糖提取率为响应值y，进行响应面分析，结果见表3。

表3 响应面分析试验设计及结果

根据单因素实验确定的各项实验条件范围，选择微波功率（420～560 W），提取时间(5～7 min)和水料比（30∶1～50∶1）。对表3 中的数据利用Design-Expert软件进行分析得到响应面回归方程：

2.2.2 回归模拟分析

方差分析结果如表4 所示。F 值为14.98，P 值小于0.01，证明试验具有显著代表性。决定系数(R=0.9506)和调整后的决定系数(Adj R=0.8872)证实该模型是高度显著的。各影响因素与响应值之间并不存在简单的线性关系。其中提取时间的F 值为56.94，微波功率的F 值为6.26，水料比的F 值为4.00，所以影响因素大小顺序为：提取时间＞微波功率＞水料比。线性相关系数微波功率（X），提取时间(X)和二次项系数(X和X)均显著(P＜0.05)。水料比（X）和二次项系数（X）均不显著，同时交互项系数(XX，XX和XX)也不显著。失拟项(P；F)均不显著，说明实验值与模型之间关联性良好。综上，可以用此模型对发酵橘皮果渣多糖提取工艺进行分析预测。

表4 回归模拟方差分析表

2.2.3 微波功率与提取时间对多糖提取率的交互影响

由图4 可看出，微波功率与提取时间的改变均对多糖提取率有影响，但两者交互作用不显著，随着各因素取值由小变大，提取率相应均呈抛物线形，且在近中心条件处出现最大值。但提取时间较微波功率坡度更为陡峭，说明提取时间的变化对多糖提取率的影响高于微波功率。

图4 微波功率与提取时间对多糖提取率的交互影响

2.2.4 微波功率与水料比对多糖提取率的交互影响

由图5 可知，微波功率与水料比的相互作用对多糖提取率的影响非常有限，两因素的坡度都较平缓不陡峭，说明二者有交互作用但不显著，微波功率的影响大于水料比的影响。

图5 微波功率与水料比对多糖提取率的交互影响

2.2.5 提取时间与水料比对多糖提取率的交互影响

由图6 可知，提取时间与水料比的交互作用对多糖提取率的影响不显著。水料比坡度平缓，而提取时间坡度陡峭，说明提取时间对多糖提取率的影响要远大于水料比对提取率的影响。

图6 提取时间与水料比对多糖提取率的交互影响

2.2.6 响应面验证实验

通过软件分析得到最优提取工艺为:微波功率为498.33 W，提取时间为7.83 min，水料比为36.31∶1，多糖提取率最优预测值为5.75%。考虑实际情况，最后确定微波辅助提取最优工艺为：微波功率为500 W，提取时间为8 min，水料比为36∶1，在此条件下发酵橘皮果渣提取率为5.67 %。实际结果与理论值偏差较小，说明该模型能够较好地预测发酵橘皮果渣多糖提取工艺条件，具有良好的实际运用价值。本实验所得发酵橘皮果渣多糖提取率与其他报道过的橘皮多糖提取率比较，明显偏少，这可能是由于发酵过程中橘皮一部分多糖成分降解为含醇溶性物质或小分子糖，提取过程中经醇沉、离心等步骤后除去单糖或醇溶性物质，导致多糖含量偏低。

3 结论

本试验以果酒发酵橘皮果渣为原料，利用微波辅助提取多糖技术，对其进行提取工艺优化研究，在单因素实验结果的基础上，采用响应曲面法进一步优化，得出发酵橘皮果渣多糖提取最适工艺条件为：微波功率为500 W，提取时间为8 min，水料比为36∶1，在此条件下多糖提取率为5.67%。