高效液相色谱波长切换法同时测定三拗片中5种成分的含量

梁冬牛，郑磊，李娟（.山东省立第三医院药学部，济南 25003；2.山东大学第二医院药学部，济南 250033）

三拗片是麻黄、苦杏仁、甘草和生姜组成的中成药制剂，具有宣肺解表的功效，用于风寒袭肺证。其中麻黄具有发汗散寒、宣肺平喘、利水消肿的作用，而盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱是麻黄的主要功效成分；苦杏仁具有降气止咳平喘、润肠通便的作用，其中主要成分为苦杏仁苷；甘草具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳缓急止痛、调和诸药的作用，其中主要功效成分甘草苷和甘草酸具有抗病毒和保护肺组织纤维化作用。三拗片质量标准收载于《中国药典》2020年版一部，分别采用两种不同的色谱条件检测麻黄中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱以及苦杏仁中苦杏仁苷的含量以控制组方中麻黄和苦杏仁的质量，增加了检测的复杂性。目前已发表的文献均是以两种成分作为指标成分控制该制剂的质量，本文以三拗片组方中麻黄、苦杏仁和甘草作为研究对象，建立高效液相色谱波长切换法同时测定其中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷和甘草酸5 种指标成分的含量，以有效控制其质量。

1 材料

1.1 仪器

LC-20A 高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器、自动进样器、柱温箱，日本岛津公司），METELER XP205 电子分析天平（精度：0.01 mg，梅特勒公司），KQ-600DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），Milli-Q 超纯水机（密理博公司）。

1.2 试药

盐酸麻黄碱（批号：171241-201809， 纯度：100.0%）、盐酸伪麻黄碱（批号：171237-201510，纯度：99.8%）、苦杏仁苷（批号：110820-201808，纯度：88.2%）、甘草苷（批号：111610-201908，纯度：95.0%）、甘草酸铵（批号：110731-202021，纯度：96.2%，甘草酸质量＝甘草酸铵质量/1.0207）（对照品，中国食品药品检定研究院），三拗片（规格：0.5 g/片，批号：2003065、2001025、1903063、1905033、1912075、1910013，济川药业集团有限公司），乙腈（色谱纯，Merck公司），磷酸（优级纯），超纯水（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Capcell pak C（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速为1.0 mL·min；检测波长为205 nm（盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷），237 nm（甘草苷和甘草酸）；柱温为30℃；进样量为10 μL；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0 ～8 min，5%A；8 ～13 min，5% ～10%A；13 ～18 min，10% ～20%A；18 ～30 min，20%～50%A）。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液 取本品20 片，除去薄膜衣，精密称定，研细，精密称取约0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液100 mL，精密称定质量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，放冷，再精密称定，用70%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液 精密称取盐酸麻黄碱对照品16.36 mg，盐酸伪麻黄碱对照品12.09 mg，苦杏仁苷对照品97.61 mg，甘草苷对照品13.73 mg，甘草酸铵对照品26.94 mg，分别置10 mL 量瓶中，用70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，质量浓度分别为盐酸麻黄碱1.636 mg·mL，盐酸伪麻黄碱1.207 mg·mL，苦杏仁苷8.609 mg·mL，甘草苷1.304 mg·mL，甘草酸2.539 mg·mL。精密量取各对照品储备液2 mL，置同一100 mL 量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液 按照《中国药典》2020年版一部中三拗片处方及制法，分别制备不含麻黄、苦杏仁、甘草的阴性样品，再按照“2.2.1”项下方法制备不含麻黄、苦杏仁、甘草的阴性样品溶液。

2.3 专属性试验

分别取“2.2”项下空白溶剂（70%甲醇溶液）、混合对照品溶液、供试品溶液与各阴性样品溶液进样测定，记录色谱图见图1。结果5 种待测成分色谱峰峰形良好，且与相邻色谱峰之间的分离度均符合要求，阴性样品溶液无干扰。同时采用高效液相色谱仪二极管阵列检测器对5 种待测成分色谱峰光学纯度进行检测，结果均为单一成分的色谱峰。

图1 三拗片高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of San’ao tablet

2.4 线性关系考察

取“2.2.2”项下对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分别置100 mL 量瓶中，用70%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，制得5 种待测成分标准系列溶液，进样测定，以各对照品溶液的质量浓度（

X

，μg·mL）为横坐标，峰面积（

Y

）为纵坐标，进行线性回归，制备标准曲线方程，结果见表1。

表1 5 种待测成分回归方程及线性范围
Tab 1 Regression equation and linearity of 5 compounds

待测成分回归方程r线性范围/（μg·mL－1）盐酸麻黄碱 Y ＝2.77×104X ＋2.63×104 0.9999 1.636 ～81.80盐酸伪麻黄碱Y ＝2.84×104X ＋1.91×104 0.9998 1.207 ～60.35苦杏仁苷Y ＝2.95×104X ＋1.93×104 0.9998 8.609 ～430.45甘草苷Y ＝2.85×104X ＋2.02×104 0.9999 1.304 ～65.20甘草酸Y ＝2.40×104X ＋2.52×104 0.9998 2.539 ～126.95

2.5 精密度试验

精密量取“2.2.2”项下对照品溶液进样测定，连续测定6 次，记录5 种待测成分色谱峰面积，并计算峰面积的

RSD

分别为0.9%、0.7%、0.7%、0.9%和1.0%，结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取本品（批号：2003065）适量，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h 进样测定，记录5 种待测成分的色谱峰面积。结果

RSD

分别为1.0%、0.8%、0.7%、1.1%和0.8%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.7 重复性试验

取本品（批号：2003065）6 份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录5 种待测成分的色谱峰面积并计算其含量。结果

RSD

分别为1.2%、1.1%、1.0%、1.3%和1.1%，表明方法的重复性良好。

2.8 回收试验

取已知含量的样品（批号：2003065）0.25 g，共6 份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入5 种待测成分对照品储备液0.7 mL，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算5 种待测成分的加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收试验结果( ＝6)
Tab 2 Recovery ( ＝6)

待测成分取样量/g样品含量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%盐酸麻黄碱0.2503 1.2265 1.1452 2.3315 96.49 98.21.3 0.2511 1.2304 1.1452 2.3517 97.91 0.2504 1.2270 1.1452 2.3644 99.32 0.2520 1.2348 1.1452 2.3462 97.05 0.2517 1.2333 1.1452 2.3613 98.50 0.2509 1.2294 1.1452 2.3704 99.63盐酸伪麻黄碱0.2503 0.8060 0.8449 1.6622 101.34 101.02.0 0.2511 0.8085 0.8449 1.6548 100.16 0.2504 0.8063 0.8449 1.6327 97.81 0.2520 0.8114 0.8449 1.6752 102.23 0.2517 0.8105 0.8449 1.6640 101.02 0.2509 0.8079 0.8449 1.6821 103.47苦杏仁苷0.2503 6.3126 6.0263 12.5147 102.92 102.81.5 0.2511 6.3327 6.0263 12.5234 102.73 0.2504 6.3151 6.0263 12.5668 103.74 0.2520 6.3554 6.0263 12.6284 104.09 0.2517 6.3479 6.0263 12.5907 103.59 0.2509 6.3277 6.0263 12.3566 100.04甘草苷0.2503 0.9061 0.9128 1.8235 100.51 102.41.3 0.2511 0.9090 0.9128 1.8525 103.37 0.2504 0.9064 0.9128 1.8379 102.04 0.2520 0.9122 0.9128 1.8456 102.25 0.2517 0.9112 0.9128 1.8621 104.18 0.2509 0.9083 0.9128 1.8419 102.28甘草酸0.2503 1.9373 1.7773 3.6523 96.49 97.01.1 0.2511 1.9435 1.7773 3.6651 96.87 0.2504 1.9381 1.7773 3.6929 98.73 0.2520 1.9505 1.7773 3.6617 96.28 0.2517 1.9482 1.7773 3.6833 97.63 0.2509 1.9420 1.7773 3.6496 96.08

2.9 耐用性试验

取“2.2.1”项下供试品溶液，改变高效液相色谱仪（Agilent 1200 和LC20A）、色谱柱型号[Agilent Zorbax SB-C（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Capcell pak C（4.6 mm×250 mm，5 μm）]、柱温（30℃、40℃和室温）和流速（0.9、1.0 和1.1 mL·min）等条件，考察对检测结果的影响。结果表明，各色谱峰的分离度均能满足系统适用性试验的要求，表明本方法的耐用性良好。

2.10 样品测定

取三拗片6 批，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算各成分的含量，结果见表3。按照《中国药典》2020年版一部三拗片质量标准中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱与苦杏仁苷的限度要求（每片含麻黄以盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的总量计不得少于3.5 mg；每片含苦杏仁以苦杏仁苷计不得少于6.5 mg），6 批次样品均符合规定。

表3 含量测定结果 (mg/片， ＝3)
Tab 3 Content determination (mg/片， ＝3)

批号 盐酸麻黄碱 盐酸伪麻黄碱 苦杏仁苷 甘草苷 甘草酸20030652.451.6112.611.813.87 20010252.171.5013.051.933.95 19030632.581.7713.171.653.67 19050332.731.8412.461.994.03 19120752.301.3812.231.533.34 19100132.912.0412.262.004.10

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

参考《中国药典》2020年版一部中麻黄、苦杏仁和甘草的含量测定色谱条件，选择以乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相，并对梯度条件进行优化，在优化后的色谱条件下，5 种待测成分色谱峰峰形良好，且与相邻的其他色谱峰均分离度良好。采用二极管阵列检测器，在200 ～400 nm 内采集5 种待测成分的紫外光谱图，结果盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷在近紫外端具有较强的末端吸收，因此选择205 nm 作为3种成分的检测波长；甘草苷和甘草酸在237 nm处具有较强的紫外吸收，因此选择237 nm 作为两种成分的检测波长。本文采用二极管阵列检测器波长切换功能，在0 ～15 min 检测波长设置为205 nm，15 min 以后切换为237 nm，从而实现在同一色谱图上各待测成分色谱峰均为最强响应色谱峰，并提高了检测灵敏度。

3.2 提取方式的优化

比较了超声波提取法和加热回流提取法对提取效果的影响，结果两种方法提取效率没有明显差别，由于超声波提取法操作简单，故选择超声波提取法。比较了水、40%甲醇、70%甲醇和甲醇作为提取溶剂的提取效果，由于各待测成分均为水溶性较强的成分，随着甲醇浓度增加，各待测成分的提取效率呈现降低的趋势；但水相比例较高时，会提取出其他干扰成分，使得色谱峰基线不平直，且对待测成分色谱峰积分产生较大影响；当采用70%甲醇作为溶剂时，各待测成分的提取效率较高，且色谱峰基线平直，待测成分色谱峰积分准确，因此选择70%甲醇溶液作为提取溶剂。

三拗片是《中国药典》2020年版一部中收载的中成药制剂，本文采用高效液相色谱波长切换法，以麻黄、苦杏仁和甘草3 种组方作为研究对象，对其中5 种重要的指标成分进行含量测定，结果准确，可为三拗片质量控制提供技术参考。