基于UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS/MS和分子网络技术快速鉴定五味子中联苯环辛二烯型木脂素类化学成分

阮振靓，邓欣祺，陈倩，王亚楠，赵道通，申冰清，王宇航，邬瑞光*，王春国*（.北京中医药大学中药学院，北京 0009；.北京中医药大学北京中医药研究院，北京 0009；.北京中医药大学生命科学学院，北京 0009）

五味子为木兰科植物五味子

Schisandra chinensis

（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实，习称“北五味子”。具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心之功效，用于久嗽虚喘，遗尿尿频，久泻不止，自汗盗汗，津伤口渴，心悸失眠等症状。现代药理学研究表明，五味子具有保护消化系统、中枢神经系统、心血管系统的作用，同时能够发挥调节内分泌系统和免疫系统的作用，在肾病、癌症、咳嗽等疾病的治疗方面具有广泛的应用前景。

迄今，国内外学者已对五味子科植物进行了大量研究，共分离鉴定出约200 多个成分，其中150 多个为木脂素类，此类化合物多数具有联苯环辛二烯型的基本骨架（如图1 所示），其独特的骨架和复杂的立体结构导致联苯环辛二烯型木脂素结构多样化，是五味子特有和主要的生物活性成分。现代药理学研究表明北五味子中的联苯环辛二烯类木脂素具有降酶保肝、抑菌、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、增强免疫等生物功能。根据化合物的结构和不同的裂解方式，联苯环烯型木脂素可以分为环辛二烯环无含氧取代、C7 含羟基取代的、C8 含酰氧基取代的、6，7-二羟基取代及其酯类和十一元环内酯类。

图1 五味子联苯环辛二烯型木脂素类成分的母核结构Fig 1 Parent nucleus structure of dibenzocyclooctadiene lignans in Schisandra chinensis

液相色谱与质谱联用（LC-MS）因其高通量和高灵敏度性能已被广泛用于五味子木脂素类和有机酸类成分的研究，但其人工解谱耗时耗力，分子网络技术（MN）不仅能快速对化合物进行聚类和可视化差异分析，而且能通过比较未知化合物与已知化合物结构的相似度，推测其可能的结构类型，与质谱等分析技术联用会更快速、全面表征中药复杂化学成分，目前该方法在中药分析领域的应用日益被重视。

目前对五味子联苯环辛二烯型木脂素类不同亚型的质谱裂解行为和结构区分缺乏系统性和针对性研究，同时将液质联用和分子网络技术相结合快速鉴定五味子联苯环辛二烯类化学成分的方法鲜有报道。有鉴于此，本研究基于UHPLCQ-Exactive-Orbitrap MS/MS，采用反相色谱系统——Cortecs C+，同时结合全球天然产物社会分子网络（GNPS）对五味子提取物进行全面表征和主要成分聚类分析，相对理清五味子该类型化学成分物质基础，为五味子的物质基础研究和类似化合物的质谱裂解规律提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Q-Exactive Orbitrap 四极杆-静电场轨道阱质谱仪：配有热喷雾离子源（HESI）、Xcalibur 4.1 化学工作站（美国Thermo Scientific 公司）；Vanquish超高效液相色谱系统（DAD 检测器，美国Thermo Scientific 公司）。Millipore Synergy UV 型超纯水机（美国Millipore 公司）；Sartorious BT 25S 型万分之一电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；超声波清洗器（北京中晟名科技有限公司，100 W）。

1.2 试药

五味子购于北京康泰民生药房，经北京中医药大学中药学院邬瑞光副教授鉴定为木兰科植物五味子

Schisandra chinensis

（Turcz.）Baill.干燥成熟果实； 五味子甲素（批号：R12O08F45508，纯度≥98%）、五味子乙素（批号：P24F12F139925，纯度≥98%）、五味子醇甲（批号：Y30N10H104712，纯度≥98%）对照品（上海源叶生物科技有限公司）；0.22 μm 微孔滤膜（天津市津腾实验设备有限公司）；甲酸、甲醇、乙腈等（质谱纯，美国Fisher 公司）。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：UHPLC CORTECS C+色谱柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流动相：0.1% 甲酸水溶液（A），乙腈溶液（B），梯度洗脱条件：0 ～3 min（5%B），3 ～45 min（5%～75%B），45 ～45.1 min（75%～5%B），45.1～50 min（5%B）；流速：0.3 mL·min；进样量：2 μL；柱温：35℃。

2.2 质谱条件

正离子模式：HESI-Ⅱ离子源，离子源温度350℃，喷雾电压3.5 kV，S-Lens RF 电压60 V，毛细管温度300℃，鞘气和辅助气均为高纯氮气（纯度＞99.99%），鞘气流速35 arb，辅助气流速流速10 arb；负离子检出模式：HESI-Ⅱ离子源，离子源温度350℃，电离源电压3.2 kV，S-Lens RF电压60 V，鞘气和辅助气均为高纯氮气（纯度＞99.99%），鞘气流速35 arb，辅助气流速10 arb。

扫描模式：一级全扫描（

m/z

120 ～1800）与数据依赖性二级质谱扫描ddMS；分辨率：70 000（Full Scan），17 500（MS/MS）；碰撞模式：高能量碰撞解离（HCD），碰撞能量：NCE30，Stepped NCE50%。

2.3 对照品溶液制备

精密称取五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲适量，加甲醇溶解配制成1 mL 溶液中含有20 μg 五味子甲素、41 μg 五味子乙素以及100 μg五味子醇甲的混合对照品溶液。

2.4 样品溶液制备

取五味子药材粉末（过三号筛）2 g，用70%甲醇定容于50 mL 量瓶内，超声提取40 min。取适量过0.22 μm 微孔滤膜，置液相进样小瓶，待测。

2.5 分子网络构建方法

使用MsConvert 软件将原始的LC-MS/MS 数据转换为mzXML 格式，并上传至GNPS 生成分子网络，余弦分数阈值设置为0.7，最小匹配碎片离子为6，topK 设置为10，母离子和子离子质量偏差为0.02 Da，最后运用Cytoscape 软件使分析结果可视化。分子网络图中可直观显示提取液中所有未知化合物与标准化合物之间的结构相似度，其中每一个节点表示一个化合物，结构类似的化合物分子会在一个分子网络中聚集成簇；节点的颜色表示不同的来源；节点与节点之间的连线表示化合物之间的相关性。

2.6 质谱分析

质谱数据通过Thermo Xcalibur 4.1 软件处理分析，对于有对照品的化合物，与对照品图谱中各已知成分的相对保留时间、准分子离子等比对，再依据各对照品二级碎片离子信息进一步确认。对于无对照品的化合物，初步进行推测，再结合文献报道、数据库中相同或类似成分的MS碎片离子进行对比分析，保证对无对照品成分的准确鉴定。

3 结果与讨论

本研究采用UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS/MS结合分子网络技术共推测鉴定出31 种联苯环辛二烯型木脂素类化学成分，其中在正离子模式下检测到的13 种联苯环辛二烯型木脂素成分为在五味子中首次鉴定。以下是对照品具体裂解途径分析和基于分子网络技术对未知成分的鉴定和聚类分析。

3.1 对照品的质谱裂解行为

联苯环烯型木脂素是中药五味子最主要的特征性成分，其中五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲是五味子中非常重要的活性成分。本文首先研究上述3 个对照品的质谱裂解行为，总结其裂解规律，为其他联苯环辛二烯型木脂素类成分的推测和鉴定提供理论依据。

3.1.1 环辛二烯环无含氧取代的联苯环烯型木脂素质谱裂解规律 五味子甲素和五味子乙素同属环辛二烯环无含氧取代的联苯环烯型木脂素类型，其区别在于C12 位的甲氧基和羟基环化的差别。对其质谱裂解行为研究发现，在HCD 碰撞裂解下，两个化合物均出现相同或相似的碎片离子

m/z

401，402，386，316，331，330，301，300 等，说明五味子甲素在碎裂过程中首先会形成五味子乙素结构的中间碎片。该类化合物另一碎裂特征是围绕环辛二烯环的跨环碎裂，其碎裂为C6-C7 和C8-C9 键断裂、并重排氢形成稳定的六元芳环结构，如五味子甲素主要形成

m/z

330，316，301 等碎片，其中

m/z

316 为基峰；而五味子乙素则以

m/z

300 为基峰。具体的质谱裂解行为见图2 和图3。

图2 五味子甲素MS/MS 图和质谱裂解途径Fig 2 MS/MS spectrum and fragmentation pathway of schisandrin A

图3 五味子乙素MS/MS 图和质谱裂解途径Fig 3 MS/MS spectrum and fragmentation pathway of schisandrin B

3.1.2 环辛二烯环C7 含羟基取代的联苯环烯型木脂素质谱裂解规律 五味子醇甲是环辛二烯环C7 含羟基取代的联苯环烯型木脂素类化合物，由于C7 位羟基易发生中性丢失一分子HO 形成较为稳定的环辛三烯环结构，较五味子甲素、五味子乙素等环辛二烯环结构稳定，因此基峰为

m/z

384，369 等完整环辛二烯环结构，而非C6-C7 和C8-C9 键断裂、重排氢后的六元芳环结构，如

m/z

346，328 等。其具体的质谱裂解行为见图4。

图4 五味子醇甲MS/MS 图和质谱裂解途径Fig 4 MS/MS spectrum and fragmentation pathway of schisandrin

综上，联苯环烯型木脂素由于母核中多甲氧基的存在，会中性丢失1 个或多个中性甲基或残基。环辛二烯环无含氧取代的化合物的主要碎裂特点是C6-C7 和C8-C9 位置的跨环断裂、并重排氢形成稳定的六元芳环为基峰，而环辛二烯环C7 含羟基取代化合物基峰则为C7 位羟基中性丢失一分子HO 形成稳定的环辛三烯环结构。

3.2 基于MS/MS 关联的分子网络分析五味子成分类别

在对五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲对照品质谱裂解规律总结的基础上，进一步运用基于MS/MS 关联的分子网络鉴定五味子化学成分。分别使用五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲对照品作为“种子”节点，被标记为粉红色。基于MS/MS 碎片模式的相似性，发现五味子中化学成分分别以“种子”节点被聚为两类，其中以“种子”节点五味子甲素和五味子乙素为主要簇类别的可能为环辛二烯环无含氧取代的化合物，而以“种子”节点五味子醇甲为主要簇类别的可能为环辛二烯环C7含羟基取代的化合物。进一步通过MS/MS 碎片及与“种子节点”的质量差异进行注释，与“种子”节点相关且被鉴定的成分的被标记为绿色（见图5）。

图5 正离子模式下五味子提取物MS/MS 关联的分子网络图Fig 5 Molecular network of MS/MS correlation of Schisandra chinensis extract in positive ion mode

将鉴定的成分进一步作为“种子”进行其他未知成分的鉴定和推测，最终在五味子中共鉴定到木脂素类化合物31 种（如表1 和图6 所示）。这些木脂素类化合物大多数为正离子模式所鉴定，戈米辛D 及戈米辛H 通过负离子模式实现鉴定。所鉴定的化合物出峰时间均在30 min 以后，推测原因为，该类成分是低极性的脂溶性化合物，30 min 之前的峰大多为五味子中的有机酸、烯烃类成分。下面具体阐释化合物鉴定的过程。

表1 UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS 鉴别五味子提取物中化学成分
Tab 1 Identification of compounds in extract based on UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS

编号电离模式间/min分子式理论分子量保留时实测分子量质量误差碎片离子信息（丰度比/%）鉴定化合物1＋ 33.410 C23H30O7418.1989 418.19920.59 332.1248（89.54）；370.1770（100）；401.1955（32.46） 戈米辛S 2*＋ 35.590 C23H30O7418.1988 418.19920.81 300.0975（0.59）；332.1236（3.85）；370.1766（100）；401.1955（23.28）；402.1982（3.62）；419.1956（2.90）戈米辛S 同分异构体1 3*＋ 41.450 C23H30O7418.1988 418.19920.94 201.0909（100）；338.1457（7.16）；370.1731（9.91）；401.1898（3.34）；419.2383（3.02）戈米辛S 同分异构体2 4*＋ 43.670 C23H30O7418.1988 418.19920.80 316.1289（33.87）；332.1250（69.95）；370.1772（67.57）；401.1975（8.27）；419.1848（100）戈米辛S 同分异构体3 5＋ 32.796 C24H32O8448.2095 448.20970.44 342.1457（100）；358.1402（30.34）；373.1641（43.64） 戈米辛Q 6＋ 40.024 C22H28O6388.1881 388.18861.18 227.0700（54.70）；231.1006（1.37）；287.0911（100）；288.0981（44.56）；301.1062（12.71）；357.1688（17.16）戈米辛J 7*＋ 49.804 C22H28O6388.1882 388.18861.06 91.0547（19.95）；371.1851（100）；388.3934（19.90）；332.1037（1.02）；389.3966（9.38）戈米辛J 同分异构体8＋ 37.660 C22H26O6386.1725 386.17291.21 299.0913（53.15）；323.1274（71.28）；331.1169（21.56）；355.1535（100）；387.1790（20.33）（＋）-戈米辛M1 9＋ 39.010 C22H26O6386.1725 386.17291.16 299.0906（36.59）；331.1158（21.50）；355.1531（100）；387.1725（37.49）（＋）-戈米辛M2 10*＋ 40.250 C22H26O6386.1724 386.17291.29 299.0905（39.25）；331.1263（31.13）；355.1534（100）；387.1786（19.40）（＋）-戈米辛M同分异构体1 11*＋ 40.730 C22H26O6386.1724 386.17291.29 299.0913（26.35）；310.1555（100）；331.1589（6.48）；355.1470（30.06）；387.1793（15.76）（＋）-戈米辛M同分异构体2

续表1

注（Note）：对照品（reference substance）；首次检定（first identification）。

编号电离模式间/min分子式理论分子量保留时实测分子量质量误差碎片离子信息（丰度比/%）鉴定化合物12*＋ 48.770 C22H26O6386.1724 386.17291.29 171.0799（55.46）；227.0699（21.23）；285.0750（100）；299.0896（14）；355.1536（16.47）；387.1799（20.29）（＋）-戈米辛M同分异构体3 13＋ 39.503 C22H24O7400.1517 400.15221.21 165.0546（100）；341.1016（34.90）；370.1784（48.40）；383.1476（9.27）；401.1963（17.17）戈米辛 R 14＋ 44.360 C24H30O7430.1988 430.19920.80 341.1378（45.04）；356.1615（100）；372.1561（49.26）；387.1796（28.80）methylisogomisin O 15*＋ 43.850 C24H30O7430.1989 430.19920.66 356.1614（100）；358.1401（15.19）；372.1562（46.63）；387.1796（28.49）methylisogomisin同分异构体16＋ 47.164 C23H26O7414.1673 414.16791.23 340.1301（100）；342.1089（53.28）；371.1484（1.90）；373.1274（29.73）neoisostegane 17*＋ 44.840 C23H26O7414.1673 414.16791.23 340.1301（100）；342.1084（56.23）；371.1485（62.33）；373.1274（34.99）neoisostegane 同分异构体1 18*＋ 45.200 C23H26O7414.1673 414.16791.23 340.1301（100）；341.1374（75.99）；356.1248（78.05）；371.1485（61.78）；373.1276（48.80）neoisostegane 同分异构体2 19*＋ 45.624 C23H26O7414.1673 414.16791.23 340.1302（100）；341.1367（77.54）；356.1243（72.30）；371.1478（59.95）neoisostegane 同分异构体3 20*＋ 46.320 C23H26O7414.1673 414.16791.23 340.1296（100）；342.1085（60.87）；371.1479（64.97）；373.1268（28.36）neoisostegane 同分异构体4 21*＋ 47.961 C23H26O7414.1673 414.16791.23 340.1296（100）；343.1165（58.17）；366.1452（64.92）；385.1633（54.18）neoisostegane 同分异构体5 22＋ 43.743 C28H36O8500.2402 500.24101.69 83.0497（84.55）；318.1093（2.08）；332.1249（75.81）；370.1770（100）propinquanin F 23＋ 41.189 C27H34O8486.2250 486.22540.81 83.0496（100）；219.1017（35.21）；295.1324（23.77）；313.1067（32.67）；355.1534（50.03）24＋ 35.023 C22H24O6384.1570 384.15730.85 191.1060（2.29）；219.1015（23.90）；247.0963（100）；339.1588（76.93）；385.1598（5.62）schisantherin F五味子素 C 25＋ 44.107 C22H24O6384.1570 384.15730.83 312.0987（25.20）；316.0938（100）；329.1012（20.32）；355.1533（84.20）；385.1613（32.89）五味子素 C 同分异构体1 26＋ 47.173 C22H24O6384.1570 384.15730.83 313.1050（34.81）；328.1295（61.71）；329.1337（7.14）；354.1446（28.77）；385.1630（100）五味子素 C 同分异构体2 27－ 36.238 C28H34O10530.2156 530.21520.74 209.1168（100）；435.2162（69.98）；453.2265（40.38） 戈米辛 D 28－ 40.820 C23H30O7418.1841 418.18351.39 181.0858（5.79）；309.1481（34.87）；310.1556（60.24）；369.1692（100）；387.1798（20.15）戈米辛 H 29#＋ 41.570 C24H32O6416.2193 416.21991.45 316.1294（100）；301.1060（29.02）；347.1478（21.82）；402.2023（24.70）五味子甲素30#＋ 43.770 C23H28O6400.1880 400.18861.53 300.0980（100）；301.1047（46.03）五味子乙素31#＋ 38.460 C24H32O7432.2139 432.21482.15 346.1405（65.02）；369.1691（66.18）；384.1925（100）；342.1454（35.09）五味子醇甲

图6 五味子提取物在正离子模式下的总离子流图Fig 6 Total ion chromatogram of Schisandra chinensis extract in positive ion mode

3.2.1 环辛二烯环无含氧取代的联苯环烯型木脂素鉴定 峰8 精确分子量为

m/z

386.1729，推测其元素组成为CHO（质量误差1.21）。在MS/MS 出现

m/z

355，331，323，299 等碎片离子（见图7）。其中碎片离子

m/z

331 和299 分别与碎片离子

m/z

387 和355 相差56 Da，其碎裂行为符合环辛二烯环丢失CH碎片离子形成稳定六元环结构的裂解规律。由此推测该化合物是环辛二烯环无含氧取代的联苯环烯型木脂素类化合物，而峰8 的精确分子量相较于五味子乙素相差一个亚甲基官能团，结合文献报道，推测化合物8 为（＋）-戈米辛M1。

图7 峰8（戈米辛M1）的MS/MS 图Fig 7 MS/MS diagram of peak 8（gomisin M1）

同理，根据高分辨质谱精确分子量（质量误差≤5）的提取离子色谱（XIC）以及数据依赖性扫描的多级质谱（MS/MS）发现，与对照品五味子甲素（CHO）和五味子乙素（CHO）具有相似碎裂特征的化合物还有9 个，分别为峰6、7、9、10、11、12、24、25、26。这些化合物在MS/MS 质谱图中，其碎片离子差均出现∆56 Da（环辛二烯环的跨环碎裂丢失CH）的碎片特征。由此推断这9 个化合物均为环辛二烯环无含氧取代的联苯环烯型木脂素。结合文献，根据保留时间和MS/MS 碎片分别鉴定这些化合物结构为戈米辛J 及其同分异构体、（＋）-戈米辛M2 及戈米辛M 同分异构体1/2/3、五味子素C 及五味子素C 同分异构体1/2，而7、10、11、12 号化合物为该植物首次鉴定。

3.2.2 环辛二烯环C7 含羟基取代的联苯环烯型木脂素鉴定 峰1 精确分子量为

m/z

418.1992，推测其元素组成为CHO（质量误差0.59）。在MS/MS 碎片中发现[M ＋H-HO]峰（

m/z

401）较为显著（见图8），与对照品五味子醇甲（CHO）的质谱裂解规律类似，推测可能为环辛二烯环C7 位羟基中性丢失一分子HO 形成稳定的环辛三烯环结构。另外，峰1 从精确分子量较于五味子醇甲相差一个亚甲基官能团，结合文献报道，推测化合物1 号为戈米辛S。

图8 峰1（戈米辛S）的MS/MS 图Fig 8 MS/MS diagram of peak 1（gomisin S）

同理，根据高分辨质谱精确分子量（质量误差≤5）的提取离子色谱（XIC）以及数据依赖性扫描的多级质谱（MS/MS）发现，1、2、3、4、13、22、23、28 等化合物的裂解特征均为中性丢失一分子HO 形成稳定的碎片离子。由此推断这8 个化合物均为环辛二烯环C7 含羟基取代的联苯环烯型木脂素。其中根据对照品五味子醇甲以及文献和保留时间、MS/MS 碎片分别鉴定1、2、3、4、13、22、23、28 化合物结构为戈米辛S 及其同分异构体1/2/3、戈米辛R、propinquanin F、schisantherin F、戈米辛H。其中化合物2 ～4号化合物为该植物首次鉴定。

4 结论

本研究采用简单的前处理同时结合UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS/MS 和分子网络技术，建立了一种快速筛查和鉴定中药五味子中联苯环辛二烯型木脂素类化学成分的分析方法。根据所获得的精确分子质量、碎片离子等信息，结合对照品信息和相关文献，共鉴定出31 种联苯环辛二烯型木脂素类化合物，其中有13 个成分为首次在五味子中检出。本研究进一步丰富和细化了五味子有效成分信息特征，为五味子化学成分的分析提供一定参考，为五味子中联苯环辛二烯型木脂素类成分的物质基础研究提供依据。

本研究拟采用UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS/MS 和分子网络技术对五味子成分进行快速筛查和深度鉴定，并解析其可能存在的新成分，以形成一套较为完整的成分表征策略，为化合物的物质基础分析提供方法学参考。