落葵薯内生真菌Fusarium graminearum TSQ-2化学成分研究

陈德坤，邹振兴*（1.中南大学湘雅药学院，长沙 410013；2.慢病诊疗小分子药物发现与转化湖南省重点实验室，长沙 410013）

植物内生菌是指存活于健康宿主植物组织器官内，不会引起直接、明显的致病症状的一类特殊的微生物类群。研究发现，植物内生菌中发现的次级代谢产物约有51%为新型化合物，高于土壤微生物（38%），且内生菌中次级代谢产物具有多种生物活性，如抗菌、抗肿瘤等，具有潜在的药用价值。目前，内生菌研究热点主要为细菌与真菌，其中植物内生真菌次级代谢产物研究已成为发现新型活性化合物的重要途径。

落葵薯

Anredera cordifolia

是落葵科藤本植物，作为一味药食同源的新兴保健蔬菜，不仅具有较好的营养保健价值，还具有降压、抗炎镇痛、抗菌等功效。近年落葵薯的研究主要集中在植物化学与药理作用，而关于其内生真菌鲜有报道。课题组前期从落葵薯珠芽部分离纯化得到一株内生真菌，并经ITS 鉴定菌种为

Fusarium graminearum

TSQ-2，采用现代色谱分离技术，从其次级代谢产物中得到了5 个化合物，经波谱数据分析，分别鉴定结构为zearalenone（1）、clavatustide C（2）、W493 C（3）、4，4，24-trimethyl cholesta-8，14，24（28）-trien-2

α

，3

β

，11

α

，12

β

，tetrol 12-acetate（4）、glycerolmonopalmitate（5），并对其肿瘤细胞毒活性和抗菌活性进行评价。

1 材料

液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用仪（液相色谱仪型号：Agilent 1290；质谱仪型号：Agilent 6500 series Q-TOF），核磁共振仪（型号：Burker AVANCE Ⅲ 500M， 瑞士Burker 公司）；电子分析天平（型号：SQP，北京赛多利斯科学仪器有限公司）；Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶（美国GE 公司）；半制备液相色谱仪（型号：安捷伦1100，安捷伦科技有限公司）；ODS 反相C填料（日本YMC 公司）；柱色谱硅胶（80 ～100 目、200 ～300 目）；大孔树脂（HPD-100 型大孔吸附树脂，沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；薄层色谱用硅胶G（烟台江友硅胶开发有限公司）；半制备色谱柱（型号：Innoval ODS-2，5 μm，10 mm×250 mm）；旋转蒸发仪（型号：EYELA N N-1100S-W）；所用试剂均为分析纯。

落葵薯植株于2019年7月采自湖南省永州市江华湘江乡庙子源村，经中南大学湘雅药学院徐康平副教授鉴定为落葵科落葵薯属植物落葵薯（

Anredera cordifolia

）的珠芽。该实验菌株分离自落葵薯珠芽，委托擎科生物有限公司进行ITS测序，NCBI 数据库blast 比对，鉴定为禾谷镰刀菌（

Fusarium graminearum

TSQ-2），GenBank 登录号为No.SUYEP0UP015。目前菌种保存于中南大学湘雅药学院天然药物化学实验室。

2 方法与结果

2.1 菌株发酵

将目标菌株植入液体培养基，恒温摇床摇荡7 d（180 r·min，28℃）作种子液，倒入20 瓶装有固体培养基的500 mL 锥形瓶中（每瓶加入250 g 大米，250 g 超纯水，121 ℃高压蒸汽灭菌25 min），于28℃恒温下静置培养28 d。

2.2 发酵产物的分离纯化

目标菌株培养于5 kg 固体培养基28 d 后，用乙酸乙酯将固体发酵物冷浸提取3 次，每次1 d，合并提取液减压浓缩得到总浸膏78 g。浸膏采取大孔树脂柱层析依次以20%乙醇、80%乙醇和100%乙醇洗脱得到3 个组分。80%乙醇洗脱部位（21.0 g）经硅胶柱层析（200 ～300 目），依次采取石油醚-乙酸乙酯（100∶0 ～1∶1）及氯仿-甲醇（100∶1 ～1∶1）梯度洗脱得到8 个组分（Fr.1 ～Fr.8）。Fr.2 经硅胶柱色谱，以石油醚-二氯甲烷（100∶1 ～0∶100）梯度洗脱得到Fr.2-1 与Fr.2-2，将Fr.2-1 经凝胶柱色谱分离得到Fr.2-1-1 和Fr.2-1-2，Fr.2-1-1 经半制备高效液相色谱（80%～95%乙腈洗脱25 min，3 mL·min）分离纯化得到化合物1（4.8 mg）和化合物4（8.1 mg）；Fr.3 经反相色谱柱，以甲醇-水（20∶80 ～100∶0）梯度洗脱得到Fr.3-1 和Fr.3-2，Fr.3-2 经半制备高效液相（60%～80%乙腈洗脱30 min，3 mL·min）分离纯化得到化合物2（2.6 mg）和化合物5（2.1 mg）；Fr.5 经硅胶色谱柱，以二氯甲烷-甲醇（100∶1 ～1∶1）梯度洗脱，得到4 个组分，其中Fr.5-4 经半制备高效液相（40%～75%乙腈洗脱30 min，3 mL·min）分离纯化得到化合物3（6.2 mg），结构见图1。

图1 化合物1 ～5 的化学结构示意图Fig 1 Chemical structures of compounds 1 ～5

2.3 结构鉴定

化合物1：淡黄色粉末（甲醇），HR-EI-MS显示

m/z

321.1713 [M ＋H]，推测分子式为CHO；H-NMR（500 MHz，MeOD）

δ

：1.34（3H，d，

J

＝6.0 Hz，H-11'），3.71（1H，t，

J

＝9.0 Hz，H-6'），5.95（1H，m，H-2'），6.20（1H，d，

J

＝2.5 Hz，H-3），6.44（1H，d，

J

＝2.5 Hz，H-5），6.71（1H，d，

J

＝15.5 Hz，H-1'）；C-NMR（125 MHz，MeOD）

δ

：19.2（C-11'），20.4（C-8''），23.7（C-4'），32.1（C-3'），32.7（C-5'），35.7（C-9'），37.2（C-7'），69.6（C-6'），74.2（C-10'），102.6（C-3），107.8（C-1，C-5），132.3（C-1'），133.2（C-2'），142.6（C-6），162.8（C-2），163.3（C-4），172.3（C-12'）。以上数据与文献报道一致，故化合物1 鉴定为zearalenone。化合物2：白色粉末（甲醇），HR-EI-MS 显示

m/z

566.4241 [M ＋H]。H-NMR（600 MHz，DMSO-

d

）

δ

：0.81（3H，m，H-12），7.35（1H，d，

J

＝6 Hz，H-28），7.90（1H，d，

J

＝8.4 Hz，H-35），8.27（1H，d，

J

＝9.0 Hz，H-7），8.39（1H，d，

J

＝7.2 Hz，H-14），8.67（1H，d，

J

＝6 Hz，H-21）；C-NMR（150 MHz，DMSO-

d

）

δ

：10.4（C-12），11.8（C-5），15.9（C-13），16.1（C-6），22.3（C-20），22.7（C-34），22.8（C-19），22.9（C-33），23.2（C-26），24.7（C-25），24.7（C-4），25.1（C-18），25.1（C-32），33.7（C-10），35.9（C-3），39.3（C-31），40.5（C-17），42.0（C-24），50.8（C-30），52.5（C-16），58.8（C-2），63.3（C-9），170.7（C-1），171.6（C-15），171.8（C-22），172.6（C-29），173.1（C-8），以上数据与文献报道一致，故化合物2 鉴定为clavatustide C。化合物3：白色粉末（甲醇），HR-EI-MS显示

m/z

888.5485 [M ＋H]， 推测分子式为CHNO。H-NMR（400 MHz，DMSO-

d

）

δ

：0.76（3H，t，

J

＝5.0 Hz，H-6），0.79（3H，d，

J

＝5.0 Hz，H-4），0.86（3H，t，

J

＝7.5 Hz，H-45），1.02（2H，m，H-5），1.13（3H，d，

J

＝5.0 Hz，H-30），3.80（1H，t，

J

＝7.5 Hz，H-2），3.90（1H，d，

J

＝10.0 Hz，H-29），3.97（1H，m，H-17），4.05（1H，m，H-25），4.49（1H，m，H-8），4.83（1H，m，H-33）；C-NMR（100 MHz，DMSO-

d

）

δ

：10.4（C-6），14.0（C-45），15.2（C-4），15.3（C-35），17.3（C-26），17.7（C-23），20.3（C-3），22.1 ～37.6（C-3/5/9/18/19/34，36 ～44），49.1（C-25），49.7（C-22），52.9（C-17），54.0（C-8），57.6（C-2），58.9（C-28），66.6（C-29），75.1（C-33），114.9（C-13），127.4（C-10），130.2（C-11/15），155.9（C-12/14），168.4（C-31），170.4（C-27），171.0（C-16），171.2（C-1），172.2（C-21），172.4（C-7），173.1（C-24），173.7（C-20）。以上数据与文献报道一致，故化合物3 鉴定为W493 C。化合物4：白色粉末（二氯甲烷），HR-EIMS 显示

m/z

519.3452 [M ＋Na]，H-NMR（400 MHz，CDCl）

δ

：0.86（3H，s，H-29），1.08（3H，s，H-30），1.02（6H，s，H-26/27），1.08（3H，s，H-18），1.25（3H，s，H-19），3.26（1H，m，H-3），4.27（1H，s，H-11），4.70（2H，d，

J

＝30.0 Hz，H-28），4.98（1H，s，H-12），5.61（1H，s，H-15）；C-NMR（100 MHz，DMSO-

d

）

δ

：15.5（C-29），16.9（C-18），18.0（C-6），18.2（C-21），21.3（C-32），21.9（C-26），22.0（C-27），22.3（C-19），27.1（C-7），27.5（C-2），28.2（C-30），30.9（C-23），33.3（C-20），33.8（C-22），34.4（C-25），35.0（C-1），35.3（C-16），37.3（C-10），39.2（C-4），46.5（C-13），49.1（C-17），50.2（C-5），69.0（C-11），78.9（C-12），79.0（C-3），106.1（C-28），121.4（C-15），126.1（C-8），138.4（C-9），146.8（C-14），156.6（C-24），171.0（C-31）。以上数据与文献报道一致，鉴定化合物4 为4，4，24-trimethyl cholesta-8，14，24（28）-trien-2

α

，3

β

，11

α

，12

β

，tetrol 12-acetate。化合物5：淡黄色油状物（二氯甲烷），HREI-MS 显示

m/z

331.2846 [M ＋H]，推测分子式为CHO。H-NMR（600 MHz，DMSO-

d

）

δ

：0.85（3H，t，

J

＝18 Hz，H-16），1.26（24H，H-4 ～15），2.28（2H，t，

J

＝6.0 Hz，H-2'）；C-NMR（150 MHz，DMSO-

d

）

δ

：14.4（C-16），22.6（C-15），24.9（C-14），28.9（C-13），29.2（C-12），29.4（C-11），29.5（C-4 ～10），31.8（C-3），34.0（C-2），63.1（C-2'），66.0（C-4'），69.8（C-3'），173.4（C-1）。以上数据与文献报道一致，故化合物5 鉴定为glycerolmonopalmitate。

2.4 生物活性评价

将两株肝癌干细胞（SMMC7721 和HepG2）在含10%胎牛血清和100 U·mL青霉素/链霉素的RPMI-1640 培养基中、37℃下培养。将初始浓度为1×10个细胞·mL的悬液（100 μL）接种到96 孔板中，置于37℃、5%CO条件下孵育24 h。再用浓度范围为1.25 ～80 μmol·L的目标化合物1 ～5 和1.25 ～80 μmol·L的阳性对照药索拉非尼处理细胞。继续培育48 h 后，每孔加入50 μL MTT（2 mg·mL）反应4 h 后加入200 μL DMSO 溶解甲臜结晶，在450 nm 处测定吸光度值（

OD

），所有结果均平行测定3 次，取平均值。计算化合物对肿瘤细胞的生长抑制率：抑制率（%）＝[1 －（

OD

－

OD

）/（

OD

－

OD

）]×100%，结果显示仅化合物4 对SMMC7721、HepG2 细胞的增殖具有抑制活性，

IC

值分别为（23.1±1.84）和（24.2±2.16）μmol·L，阳性对照组索拉非尼的

IC

值分别为（2.19±0.04）和（4.80±0.08）μmol·L。同时还利用96 孔板稀释法评估了化合物1 ～5 对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和大肠埃希菌（

E.coil

）的抑制作用，结果显示化合物1 ～5在最大浓度500 μg·mL下均未显示抑菌活性。

3 讨论

植物内生菌是一个巨大的微生物资源库，药用植物内生真菌作为一类特殊的微生物群体，能够产生结构多样的活性次级代谢产物，其中相当一部分具有抗肿瘤活性，其结构类型包括生物碱、萜类、甾体、聚酮类、脂肪酸类等，表现出潜在的应用价值，因此从药用植物中分离内生菌并对其次级代谢产物进行研究已成为天然药物化学研究的热点。本研究首次对落葵薯植物内生菌进行研究，并从中分离得到两个环五肽（1 ～2），一个三萜（3）以及一个二羟基苯酸内酯（4）和一个长链脂肪酸（5）。本研究报道的化合物2 和5为首次从

Fusarium

属菌中分离获得。在体外抗肿瘤活性测试结果显示，化合物4 对SMMC-7721和HepG2 细胞的增殖有中等抑制活性。本研究填补了落葵薯内生真菌化学成分研究领域的空白，丰富了落葵薯内生真菌资源多样性，在一定程度上丰富了真菌

Fusarium graminearum

次级代谢产物化学成分和生物活性，为禾谷镰刀菌次生代谢产物的利用提供了一定的科学依据。