氨基末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）化学发光免疫冻干微球定量检测试剂研究

陈珠金

（安邦（厦门）生物科技有限公司，福建厦门 361000）

脑钠肽（Brain Natriuretic Peptide，BNP）实际上主要来源于心室，因其由日本学者SUDOH[1]1988年首次从猪脑中提取出来而得名。BNP主要由心室肌细胞合成和分泌，具有较强的舒张血管作用，可抵御容量负荷过重及高血压，心室负荷增加能导致BNP释放。氨基末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）是脑钠肽前体之一，是BNP激素原分裂后没有活性的N-末端片段，主要由左心室分泌。与BNP相比，NT-proBNP半衰期更长，更稳定，其浓度可反映短暂时间内新合成的而不是贮存的BNP释放。近年来的研究表明，血清NT-proBNP水平在高血压诊断、心力衰竭的预后判断与治疗指导方面有重要价值[2-3]。

化学发光法检测NT-proBNP能做到定量检测，但发光免疫试剂在保存和运输条件上要求苛刻，一般需要保存在2～8 ℃，需要冷链运输。这些条件如果得不到满足，会对发光免疫试剂的性能造成很大的影响，甚至导致试剂失效。本文研制的试剂可实现常温储存且单人份包装，以羧基修饰的磁性微球偶联NT-proBNP Ab1，利用吖啶磺酰胺标记NT-proBNP Ab2，添加试剂储存剂，二者混合，利用液氮点样仪器点样，形成冷冻微球，将冷冻微球转入冻干机，真空冷冻干燥后充保护气体分装保存。检测时，加入纯化水与待测样本，等到待测物中的NT-proBNP抗原与试剂混合后，形成双抗体夹心复合物结合在磁珠上，清洗分离，复合物在激发液的作用下发光，相对发光强度（RLU）与样本中的NT-proBNP抗原浓度呈正相关。从而研制出直接化学发光免疫分析法定量检测氨基末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）的冻干微球单人份包装试剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验试剂

NT-proBNP配对抗体，菲鹏生物股份有限公司；NT-proBNP校准品，上海领潮生物科技有限公司；人血清白蛋白、胆红素、血红素、甘油三酯，Sigma-Aldrich公司；磁性微球（羧基，2.9 μm），日本JSR株式会社；吖啶磺酰胺（NSP-SA-NHS），深圳市美凯特科技有限公司；脱盐柱，Thermo Fisher公司；二甲基甲酰胺（DMF）、赖氨酸、酪蛋白、牛血清白蛋白BSA，Sigma-Aldrich公司；甘露醇、海藻糖、明胶、硫代硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚乙二醇PEG20000，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 实验仪器

SMART 500全自动化学发光测定仪，重庆科斯迈生物科技有限公司；1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪，安捷伦科技（中国）有限公司。

1.1.3 临床样本

定值人血清100例（福建医科大学附属协和医院提供，定值结果由罗氏电化学发光检测）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制方法

（1）试剂储存液配制：甘露醇5%，海藻糖10%，酪蛋白1%，吐温20 0.01%、明胶0.5%以及防腐剂0.1%，硫代硫酸钠5 mmol/mL；乙二胺四乙酸二钠5 mmol/mL，用Tris-HCl缓冲盐溶液（TBS）（pH7.0～7.4，50 mmol）溶解稀释以上组分到相应的浓度。

（2）激发液配制：激发液A为0.1%的H2O2+0.1 mol/L的HNO3，激发液B为0.2 mol/L的NaOH+1%的TritonX-100。

1.2.2 磁性微球偶联NT-proBNP-Ab1制备（试剂A）

取10 mg羧基修饰的磁性微球混悬液于样品管中，加入900 μL的2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）溶液（pH5.0，0.1 mol/mL）混匀，然后分别加入100 μL的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC）溶液（10 mg/mL）和200 μL的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液（10 mg/mL），室温反应30 min，活化磁性微球；去上清，磁珠重新混悬液于1 mL的MES溶液（pH5.0，0.1 mol/mL）；随后直接加入100 μg的鳞癌抗原抗体1，37 ℃孵育3 h；去上清，加入50 μL的BSA（10 mg/mL）室温封闭1 h后，用0.025 mol/mL的TBST（即 TBS with Tween-20，含有 Tris-Hcl， NaCl，tween20 这3种物质）缓冲液洗涤4次，除去游离抗体，加入试剂储存液10 mL，制备成试剂A。

1.2.3 吖啶磺酰胺标记NT-proBNP-Ab2制备（试剂B）

取适量抗体，用碳酸盐缓冲液（pH9.6，50 mmol/L）稀释至1 mg/mL，脱盐柱纯化；计算抗体的摩尔数，在纯化后的抗体中加入15倍摩尔数的吖啶磺酰胺（DMF稀释），4 ℃避光反应1 h；加入20倍抗体摩尔数的赖氨酸避光反应30 min，用高效液相色谱（流动相为pH6.5、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，分子筛色谱柱，检测波长280 nm）纯化标记后的复合物，加入等体积甘油在-20 ℃冻存，使用时用试剂储存液稀释至抗体浓度为0.001 mg/mL，制备成试剂B。

1.2.4 试剂点样冻干

试剂A与试剂B按1∶1混合均匀，加入到液氮点样仪中，设置点样量每滴为20 μL，点样形成冷冻微球，将冷冻微球转入冻干机，冷冻干燥后充保护气体分装保存。

1.2.5 样品检测

30 μL待测样本和120 μL去离子水加入到带有冻干微球试剂的样品杯中；37 ℃条件下温育10 min后，洗涤液清洗3次，最后加入激发液A和激发液B各100 μL，检测相对发光强度。

1.2.6 数据分析

在免疫反应中，对NT-proBNP采用3个平行孔测定后取其平均值，相对发光强度（RLU）和相应浓度进行4参量拟合，建立主校准曲线，扫描到仪器中。通过所保存的校准数据，检测相应样本时系统软件自动地确定病人的测试结果，结果单位以pmol/mL的形式给出。

2 结果与分析

2.1 试剂外观及理化性质

试剂呈均匀光滑的圆球状固体，加纯化水，微球迅速崩解复溶成均匀带有磁珠粉末的混悬液，磁珠不团聚，液体除磁珠粉末外无其他未溶解物。

2.2 线性范围

将接近线性范围上限标准品（35 000 pmol/mL）的样本用正常人血清稀释6个浓度，其中稀释的最小浓度20 pmol/mL接近线性范围下限。对每一个样本均检测3次，计算平均值，相对发光强度值做直线拟合。如图1所示，线性范围（20～35 000 pmol/mL）内，线性相关系数R2=0.999，显示了良好的相关性。

图1 化学发光法冻干微球试剂测定NT-proBNP的标准曲线

2.3 最低检出限

用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测度20次，得出20次检测结果的RLU值，计算其平均值（）和标准差（SD），将+2SD所对应的RLU值带入主校准曲线中，求出对应的浓度值，结果不高于20 pmol/mL，因此设定20 pmol/mL即为最低检出限。

2.4 精密性

批内精密性，用1 000 pmol/mL和10 000 pmol/mL浓度NT-proBNP，每个浓度平行检测10次，分别求其平均值和标准差（SD），求得批内变异系数＜5%。

2.5 回收率

将3例高值样本加入到3份正常人血清样品（内源性检测浓度均低于100 pmol/mL）中，所加入高值样本与正常人血清之间体积比为1∶9，平均回收率95.7%。

2.6 稳定性

将试剂在45 ℃放置90 d，检测NT-proBNP，相对发光强度与放置前对比，确定45 ℃储存90 d热稳定性的变化幅度≤10%；按试剂储存条件（25 ℃±5 ℃）放置5个月，检测标准品，相对发光强度与放置前对比，稳定性的变化幅度≤10%。本方法制得的试剂与常规化学发光试剂相比稳定性显著升高。

2.7 比对试验

收集福建医科大学附属协和医院提供的57例临床标本，用研究试剂盒测定，并与罗氏电化学发光测定结果对比，结果如图2所示。回归方程y=0.994 2x+173.13，相关系数R2=0.976 4，表明两者测试血清中NT-proBNP抗原的含量具有良好的相关性。

图2 本研究试剂检测结果与罗氏电化学试剂检测结果相关性

2.8 特异性

如表1所示，通过对常见的干扰因素（人血清白蛋白、甘油三酯、血红素、胆红素以及BNP）对检测结果的影响判定方法的特异性，干扰物测定值均小于20 pmol/mL，表明该方法具有良好的特异性。

表1 试剂特异性分析

3 结论

近年来，我国心力衰竭发病率不断升高，有资料显示我国患有心血管疾病的患者约为2.9亿人，其中心衰患者约占15.5%[4]。在临床治疗中，早期诊断具有重要价值，可有效控制患者病情，避免患者病情加重。临床研究证实，当发生心力衰竭时，NT-proBNP水平均会显著上升，其幅度与心力衰竭的严重程度正相关；病情缓解或有效治疗后回降，但难以完全恢复到健康人水平。因此NT-proBNP的检测是心力衰竭患者鉴别诊断、预后评定和指导治疗中的重要指标。研究提出，NT-proBNP浓度对早期心衰患者具有诊断价值[5]。

化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immuno-Assay，CLIA）是在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术，可以根据化学反应产生的发光强度确定物质的含量，该方法在生物医学研究和临床检测中已经得到广泛的应用[6]。冻干工艺可有效解决发光免疫试剂不能常温保存与运输的问题。

本文成功研制了可实现单人份包装常温储存的化学发光免疫试剂，具有灵敏度高、特异性好、线性范围广，稳定性好，可常温储存等特点，能够满足临床检测的需要，指导心衰患者的临床诊断和治疗，为患者治疗提供可靠的数据支持。