中药发酵制剂对仔猪腹泻的防治研究

林松泉

（厦门惠盈动物科技有限公司，福建 厦门 361023）

仔猪断奶后发生应激性腹泻的可能性较大，一般由大肠杆菌引起，具有较高的死亡率。在细菌性疾病的防治中普遍使用抗生素，而抗生素的使用往往存在毒副作用、菌株耐药性与药物残留等问题[1-3]。根据农业部第194号公告，从2020年起全面禁抗、限抗，因此研究抗生素替代品具有深远意义。

益生菌能有效抑制病原菌，提高动物免疫力，与抗生素相比，具有抗菌活性，却无抗生素弊端，为优选的替抗品之一[4-5]。在中药发酵过程中益生菌能利用所分泌的酶类或有机酸对中药进行炮制，经微生物发酵过后的中药，不仅中药活性成分得到保护，还能有效提高中药成分的提取率而且能降低中药的毒副作用[6-8]。

本研究是在“仔猪腹泻病原菌分离及其防治”[9]的研究基础上所延伸的后续研究，通过对发酵中药耐受性试验入筛选最适发酵菌株，并对该菌株进行中药发酵，旨在获得一种中药发酵制剂来防治大肠杆菌引发的腹泻，从而减少抗生素的使用。

1 材料与方法

1.1 中药发酵培养基

金银花、蒲公英、白头翁和黄柏均为10 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母浸膏10 g/L，pH 7.2，其中中药经过超微粉碎处理。

1.2 试验菌株

凝结芽孢杆菌 GDM1.645（Bacillus coagulans）、植物乳杆菌 GDM1.191（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌GDM1.80（Lactobacillus casei）、嗜酸乳杆菌GDM1.208（Lactobacillus acidophilus）购自广东省微生物菌种保藏中心，鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）为本实验室分离纯化。大肠杆菌[9]（Escherichia coli）分离自腹泻仔猪肠道。

1.3 试验药物

庆大霉素，生产批号：210618，上海沃凯化学试剂有限公司产品；酵母浸膏，生产批号：2020111601DL，安琪酵母股份有限公司产品；无水葡萄糖，生产批号：20210522-1，潍坊盛泰药业有限公司产品；金银花、蒲公英、白头翁和黄柏皆为药店采购。

1.4 试验动物

28日龄BALB/c小鼠购自武汉巴菲尔生物技术服务有限公司；30日龄断奶仔猪由福建某猪养殖场提供。

1.5 试验方法

1.5.1 中药发酵菌株筛选。采用以中药发酵培养基作为中药耐受性筛选培养基，100 mL三角瓶装液80 mL，经115℃灭菌30 min，分别按5%接种量接入活化后的供试验用菌株，采用氢氧化钠调节pH至7.2，36℃厌氧培养48 h。期间取样检测24 h及48 h的pH值及活菌数，活菌数采用10倍稀释涂布方法检测活菌数。

1.5.2 中药发酵制备。以中药发酵培养基为配方，采用150 L发酵罐，制备100 L中药发酵液，经115℃灭菌蒸煮30 min，冷却，按5%接入筛选获得的复合益生菌菌种培养液，采用氢氧化钠调节pH至7.2，36℃厌氧培养48 h，灌装获得中药发酵液，检测活菌数。其中，复合益生菌菌种按体积接种比例为凝结芽孢杆菌2%、鼠李糖乳杆菌2%、植物乳杆菌1%。

中药对照为中药发酵培养基直接以115℃蒸煮灭菌30 min，冷却后灌装。益生菌对照组不加中药成分，以葡萄糖20 g/L、酵母浸膏10 g/L发酵复合益生菌，采用氢氧化钠调节pH至7.2，36℃厌氧培养48 h后灌装。

1.5.3 中药发酵抑菌试验。采用牛津杯法[10]，将大肠杆菌接种于平板活化，挑取菌泥，稀释至活菌数约为108CFU·mL-1，吸取1 mL菌悬液加入50℃保温的100 mL营养琼脂培养基中摇匀，倾倒于平板，冷却凝固后将牛津杯置于平板上，分别往牛津杯中加入中药发酵液，中药对照液及其益生菌对照发酵液各0.25 mL，4℃冰箱静置2 h后37℃下培养24 h。观察有无抑菌圈产生，并用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。

1.5.4 动物致病性及治疗试验。随机选取120只健康小鼠分成6组，每组20只，分别设空白对照组、病菌感染组、庆大霉素组、中药发酵组、中药对照组和益生菌对照组。其中除空白对照组外，其余组小鼠腹腔注射大肠杆菌菌浓约为106CFU·mL-1的病菌悬液，用量为0.5 mL/只，对照组注射0.5 mL/只的0.85%无菌生理盐水。庆大霉素组按1 g/kg用药量加入日粮及饮水中，而中药发酵组、中药对照组和益生菌对照组在日粮及饮水中按1 g/kg各自加入样液。6组日常喂食管理一致，饮水自由。如果有个别小鼠死亡，及时取出，连续观察7 d，计算小鼠死亡只数，并剖检死亡小鼠，取脏器进行病菌分离。

1.5.5 仔猪腹泻预防试验。在福建某猪养殖场随机选取30日龄断奶仔猪120只，平均分为4组，雌雄各半。分别设为空白对照组、中药发酵组、中药对照组和益生菌对照组。中药发酵组、中药对照组和益生菌对照组在日粮及饮水中按1 g/kg各自加入样液。4组日常喂食管理一致，试验为期30 d，统计试验期间腹泻及死亡仔猪数。

1.6 数据统计与分析

试验数据采用Excel2020整理及标准差分析，结果以“平均数±标准差”表示，并采用SPSS22.0软件中Duncan法进行多重比较分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 中药发酵菌株筛选

选取5株可以抑制大肠杆菌的益生菌进行中药发酵培养，测试益生菌对中药的耐受性，结果如表1所示。在整个中药发酵过程中，5株益生菌发酵产酸，使中药发酵培养基pH呈下降趋势。在24 h时活菌数最高的为植物乳杆菌2.6×109CFU·mL-1，而鼠李糖乳杆菌为1.2×109CFU·mL-1，其他3株菌活菌数皆在107CFU·mL-1范围内，说明这两株乳酸菌能在该中药发酵培养基中良好生长，不受中药抑制或抑制程度低。在中药发酵48 h后，凝结芽孢杆菌、干酪乳杆菌与嗜酸乳杆菌活菌数有所提高，以凝结芽孢杆菌所提升幅度较大，故所受中药抑制较低。综合考虑，选取凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌及鼠李糖乳杆菌这3株益生菌作为发酵中药的菌株。

表1 益生菌中药发酵结果

2.2 中药发酵制备及抑菌试验结果

以中药发酵培养基为配方，采用凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌及鼠李糖乳杆菌作为发酵益生菌发酵中药，制备中药发酵液。经检测，总活菌数为2.2×109CFU·mL-1，pH 为 3.86。未经发酵的中药 pH 为 5.64。未加中药的益生菌发酵液经检测，总活菌数为3.5×109CFU·mL-1，pH为3.66，如表2所示。在抑制大肠杆菌中，大肠杆菌对中药发酵液及益生菌发酵液表现高敏感，对纯中药液表现中敏感，说明单纯的中药制剂对抑制大肠杆菌的抑制作用较其他2种制剂弱，且中药发酵液的抑制效果略优于益生菌发酵液。

表2 中药发酵及抑制大肠杆菌结果①

2.3 动物致病性及治疗试验

从腹泻仔猪分离出来的大肠杆菌[1]经过菌株毒性及其防治效果的测试试验，结果如表3所示。该大肠杆菌具有较强的致病能力，仔猪感染后的前3天内出现较高的死亡率，达90%。在庆大霉素药物或中药发酵制剂的干预治疗下，仔猪死亡率明显下降，分别为15%与20%，与病菌感染组相比达到极显著差异（P＜0.01）。而单纯的中药或益生菌制剂，其治疗效果不如中药发酵制剂，但也与病菌感染组相比差异显著（P＜0.05）。

表3 小鼠致病性试验结果

中药发酵制剂在养殖场的仔猪腹泻预防实际运用中，试验结果如表4所示，在日粮中添加中药发酵制剂仔猪腹泻率与死亡率分别为6.67%及0%，与空白对照组腹泻率46.67%与死亡率42.86%相比，差异极显著（P＜0.01）。中药对照组与益生菌对照组在仔猪预防腹泻试验中，效果不如中药发酵组，该结果与小鼠的试验结果也较为一致。

表4 仔猪预防腹泻试验结果

3 讨论

从腹泻仔猪的小肠内容物及粪便中分离出一株大肠杆菌，林松泉的[9]研究表明，该病菌具有较强的致病性，且对大多数的抗生素具有耐药性，但对头孢哌酮、庆大霉素药物表现敏感，且凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌与嗜酸乳杆菌等乳酸菌对其有良好的抑制作用。经过益生菌对中药的耐受性筛选，获得3株具有发酵中药优势菌株，经过48 h厌氧发酵，获得中药发酵制剂。经过动物试验研究表明，该中药发酵制剂能有效防治仔猪腹泻，并降低其发病率和死亡率。

中药运用于仔猪腹泻的治疗也有报道，如田明[12]、王俊俊[13]和杨久春等人[14]利用中药制剂治疗仔猪腹泻，且取得显著效果。同时有研究表明[15-18]，中药经过微生物发酵后，其药用效果明显优于未发酵。而在本研究中，不管是对大肠杆菌的抑制效果或是在动物性试验中，中药发酵制剂的作用效果皆优于未发酵的纯中药制剂，该结果与上述观点一致。

陈新瑶[19]、段雪磊[20]、韩宇等人[21]采用中药发酵制剂添加在断奶仔猪日粮中，能显著降低仔猪腹泻率，并提高免疫能力。他们研究所采用的单一中药成分与本文研究的中药不同，但在降低仔猪腹泻率方面皆有良好效果，说明在防治仔猪腹泻所用中药具有多样性。

本研究也有不足之处。所制备的中药发酵制剂是针对某养猪场仔猪腹泻所筛选的大肠杆菌，对防治该场仔猪腹泻具有良好效果，但该制剂对其他养猪场或其他畜禽动物的防治腹泻效果未做验证。后续将补充该方面研究，较为全面地分析中药发酵制剂的特性。

4 结论

本研究通过凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌及鼠李糖乳杆菌发酵4种中药，获得一种中药发酵制剂。经过试验研究表明，该中药制剂能有效抑制大肠杆菌，防治仔猪腹泻，降低腹泻发生率及死亡率。在仔猪日粮中，添加该中药发酵制剂，能减少抗生素的使用，达到替抗、减抗的目的。