科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌cylE基因的克隆及抗原性分析

冯浩展，任宪峰，王 华，锡林高娃

（内蒙古民族大学生命科学与食品学院，内蒙古乳源性致病菌工程防控中心，内蒙古 通辽 028043）

乳腺炎是奶牛最常见且较为多发的一种乳腺疾病，乳腺炎不仅影响乳汁品质，而且降低产奶量。我国因临床型奶牛乳腺炎淘汰的奶牛约占总淘汰牛的9%～11%，造成的经济损失超过了3.16亿元[1]。B族链球菌（GBS）学名无乳链球菌（streptococcus agalactiea,S.agalactiea），GBS感染引发的乳腺炎是最常见的疾病之一。同时无乳链球菌也能引发奶牛乳腺炎并通过乳制品感染人类。其感染人群主要为饮用乳制品及接触奶牛的免疫缺陷者[2]。据国外流行病学调查显示，在引起败血症的致病菌中，无乳链球菌占败血症总致病菌数的85%以上[3]。同时，GBS也是造成孕妇产褥期脓毒血症和新生儿脑膜炎的一个重要原因。该菌寄生在产妇生殖道内，可导致婴儿发生感染[4]，也可引起产后感染、菌血症、心内膜炎、皮肤和软组织感染及骨髓炎。更为重要的是GBS通过牛奶和肉类等对孕妇和老人等免疫力低下或免疫功能不全的人群造成感染，引起败血症和心内膜炎等疾病[5]。

溶血素又称细胞溶素，根据在血琼脂培养基上的溶血特征可分为α溶血素、β溶血素和γ溶血素3种类型。科尔沁牛乳腺炎是由β溶血型无乳链球菌造成的，它分泌的β-溶血素属于穿孔毒素[6]，它能溶解红细胞并使红细胞释放血红蛋白。溶血素不同于其他通过哺乳动物靶细胞内化的毒素，而是作用于细胞膜，造成其结构和功能的紊乱，使大量细胞内的成分泄漏，导致细胞死亡。更可怕的是溶血素不仅溶解红细胞，还损害其他多种类型的真核细胞，包括血小板、成纤维细胞、心肌细胞、单核细胞、粒细胞和内皮细胞等[7]。

近年来，人们发现溶血素并非是cylE基因的表达产物。Rosa-Fraile等[8]的研究提出，GBS的溶血性和细胞溶解活性是由鸟氨酸鼠李糖多烯色素而不是由cylE蛋白引起的。布日额等[9]通过构建cylE基因缺陷型菌株发现，缺失cylE基因的无乳链球菌将失去溶血性，因此cylE基因对溶血素的产生是必要的。如今，由于抗生素的滥用，导致耐药菌的数量和种类持续增加，病原菌的防控依然是比较有效的手段，这就需要找到病原菌携带的有效免疫抗原。通过克隆科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌cylE基因并分析其编码蛋白性质，为以后研究溶血素合成途径及制备无乳链球菌新型疫苗做理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

无乳链球菌为内蒙古通辽地区患乳腺炎科尔沁牛的乳汁临床分离株；大肠杆菌DH5α、pMD 18-T载体、Ecor I与 Hind III内切酶、Taq DNA聚合酶、DNAMarker、DNA凝胶回收试剂盒及小量质粒提取试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.2 引物设计与合成

参照GenBank已公布牛源无乳链球菌的cylE基因序列(AF093787)，采用Primer 5.0软件设计1对引物，序列如下：

cylE1：CGAAAGCTTATGAAAGATGATAATA；

cylE2：TCGGAATTCTCATTTTTCTTCACACTT。

1.3 无乳链球菌DNA模板制备

将科尔沁牛乳腺炎临床分离获得的无乳链球菌进行纯化培养，然后参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明提取基因组DNA，经电泳鉴定后置于-20℃冰箱保存备用。

1.4 目的基因的PCR扩增

PCR 反应体系 50.0 μL,10×PCR Buffer 5.0 μL,dNTP 4.0 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各 1.0 μL,DNA 模板 5.0 μL,Taq DNA 合酶 (5 U/μL)0.25 μL,ddH2O 33.75 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min;94 ℃30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s，进行30个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。

1.5 克隆载体构建与鉴定

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，利用DNA凝胶回收试剂盒进行回收。将回收的片段与pMD 18-T载体在16℃下连接过夜后，转化DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素(Amp+)的LB培养基对菌落进行筛选，并提取重组质粒。提取的重组质粒命名为pMD 18-T-cylE，同时进行PCR及酶切鉴定。

1.6 目的基因序列分析

将转化重组质粒pMD 18-T-cylE的感受态细胞DH5α送至北京华大基因研究中心进行测序，利用DNASTAR软件对其推导蛋白二级结构及其抗原性进行预测分析。

2 结果与分析

2.1 目的基因的PCR扩增结果

从患乳腺炎科尔沁牛乳汁中分离获得的无乳链球菌基因组总DNA为模板，合成的P1/P2为引物进行cylE基因PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，发现在1000 bp附近有一条特异条带(见图1)，与预期结果相符。

图1 cylE基因PCR扩增产物的电泳鉴定结果

2.2 重组质粒的PCR及酶切鉴定结果

重组质粒pMD 18-T-cylE经PCR鉴定，结果扩增出约1000 bp的片段;经Hind III单酶切后得到约3700 bp的片段;经Ecor I、Hind III双酶切则得到约1000 bp和2700 bp的两个片段(见图2)。酶切获得的片段及PCR扩增片段均与预期结果相符，说明重组质粒构建正确。

图2 重组质粒pMD 18-T-cylE的酶切PCR及酶切鉴定结果

2.3 基因序列及其推导氨基酸序列分析结果

重组质粒pMD 18-T-cylE经测序结果发现，无乳链球菌cylE基因片段共由999个碱基组成。将克隆获得的cylE基因序列与Genbnak已公布的牛源无乳链球菌cylE基因序列进行比对,其两者核苷酸序列相似性为99.9%，仅有1个核苷酸发生突变（1712C→A）。

2.4 氨基酸序列及其二级结构预测分析结果

通过DNASTAR软件分析，经克隆获得的cylE基因序列共编码333个氨基酸。与Genbnak已公布的牛源无乳链球菌cylE基因序列进行比对，其两者氨基酸序列相似度为99.7%，仅有1处氨基酸发生了突变571Ala→Asp。

使用PSIPRED在线分析网站，对cylE蛋白序列的二级结构进行分析。结果显示，无乳链球菌cylE蛋白共有63个α-螺旋，有133个β-折叠。其中α-螺旋占 18.92%（63/333），β-折叠占 39.93%（133/333）。其余为无规则卷曲。

2.5 cylE基因预测蛋白的亲水性及其抗原性预测分析

图3 cylE基因序列的相似性分析结果

图4 cylE基因编码氨基酸序列的相似性分析结果

图5 cylE基因编码蛋白质二级结构的预测分析结果

使用DNASTAR软件对cylE基因氨基酸序列进行分析。结果表明，cylE预测蛋白的亲水区域较广，其主要分布在 6～19、30～40、67～151、184～198、208～229、244～285和307～331位氨基酸。而且亲水区域在蛋白序列的N端较多。根据Jameson-Wolf方案预测其抗原指数。cylE预测蛋白含有较多抗原指数较高的区域，主要分布在 4～16、24～39、56～62、67～76、90～99、108～124、128～149、156～161、171～184、228～207、241～251、258～281和321～330位氨基酸，抗原性良好。综上所述，cylE蛋白是亲水蛋白，具有良好的抗原性。

图6 cylE基因编码蛋白质疏水性及抗原性的预测分析结果

3 讨论

至今为止，cylE的作用机制尚未明了，但它却对溶血素的产生有着至关重要的作用，在无乳链球菌的较多致病因子中，溶血素起着破坏宿主细胞、使细胞内成分大量泄漏和导致细胞死亡的作用，是无乳链球菌致病的主要因子。

根据试验测序获得cylE基因序列为999 bp，使用获得序列与NCBI数据库对比后发现，相似性为99.9%，其中原1712位的C突变为A，导致其氨基酸序列第571位丙氨酸突变为天冬氨酸。

Whidbey等[10]的研究表明，溶血素的实质是名为鸟氨酸鼠李糖脂的色素，值得注意的是，cylE基因的存在是溶血素产生的必要条件。目前虽然针对表面蛋白的疫苗在小鼠感染模型中被证明能提供抗GBS的保护[11]，但基于蛋白质的疫苗不能中和这种脂质毒素的作用，我们可以针对cylE基因表达产物制作疫苗来抑制溶血素的产生。而本试验通过对cylE蛋白序列进行亲水性和抗原性分析发现，cylE蛋白具有较高的亲水性，同时也具有良好的抗原性。符合候选靶标抗原的要求，说明cylE蛋白是防治无乳链球菌病的理想抗原候选分子。

科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌cylE基因编码的蛋白具有良好的抗原性，可作为防治无乳链球菌的抗原候选分子之一，为后续研究预防牛乳腺炎疫苗提供理论参考依据。