苦参碱对免疫低下小鼠的脾/胸腺指数、耳肿胀度、碳廓清能力的影响

曹晓东 ，张 楠 ，张子英 ，刘 颖 ，杜 华 ，韩 帅

（1.内蒙古医科大学GLP中心，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古医科大学公共卫生学院，内蒙古 呼和浩特 010018；3.内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；4.内蒙古医科大学实验动物中心，内蒙古 呼和浩特 010018）

机体的免疫系统是维持机体正常运转、抵御外界刺激的重要保证，近20年来自身免疫性疾病和过敏性疾病的发病率呈不断上升趋势[1]。使用中药来增强免疫力，具有副作用小、来源广泛的优势。以中药养生和中医体质辨识为基础，对中药中免疫功能活性物质进行研发已经成为中药研究的热点问题。Matrine的来源非常广泛，可从大多数豆科植物中提取，含量最为丰富的是苦参和苦豆子等植物，其药理作用主要包括抗炎、抗过敏、抗病毒、镇痛、平喘、抗肝纤维化、抗肿瘤和免疫调节等[2]。Matrine对小鼠的免疫功能具有双向调节作用，但matrine调节免疫功能的效应复杂，系统地研究matrine对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用不仅有利于将matrine作为免疫调节药物拓宽研发探索途径，还可以为全面了解matrine的免疫调节作用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物。SPF级昆明小鼠60只，体重为18～22 g，雌雄各半，购买自内蒙古医科大学实验动物中心 (生产许可证号：SCXK-2020-0001；批准号：京动字 8910M047)，自由饮食，饲养环境符合GB-14925-2010实验动物环境及设施要求，适应性饲养3 d后，采用分层分组法进行分组，分为空白对照组（CON）、免疫功能低下组(环磷酰胺)、左旋咪唑(levamisole)阳性对照组，以及matrine高剂量组、中剂量组和低剂量组，每组10只。

1.1.2 试剂与仪器。matrine（批号：20200912，Solarbio公司），MTT 试剂（Sigma 公司），胎牛血清（Gibco 公司），胰酶-EDTA消化液（Hyclone公司）；96孔细胞培养板（Corning 公司），CO2培养箱（美国 Thermo 公司）；倒置荧光显微镜 （Olympus），环磷酰胺（cyclophos phamide，CTX）(Sigma 公司)，刀豆蛋白（concanavalin A，Con A） (Sigma公司)，左旋咪唑(levamisole)，二硝基氯苯丙酮，印度墨汁（phygene biotechnology），2%绵羊红细胞 （北京博尔西科技有限公司），都氏试剂，10%豚鼠补体，小鼠脾淋巴细胞分离液试剂盒（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）。

1.2 试验方法

免疫功能低下组(环磷酰胺)、matrine高剂量组、中剂量组和低剂量组，4组用于制备免疫力低下的小鼠模型，于试验第1天腹腔注射150 mg/kg剂量的环磷酰胺；第2天环磷酰胺剂量为80 mg/kg，第3天与第2天注射剂量相同。空白对照组 （CON）、左旋咪唑(levamisole)阳性对照组腹腔分别注射相同体积的生理盐水。之后，matrine高、中、低剂量组腹腔注射matrine，高剂量组为160 mg/kg，中剂量组为80 mg/kg，低剂量组为40 mg/kg。连续给药7 d，对照组和左旋咪唑组腹腔分别注射相同体积的生理盐水和40 mg/kg体重的左旋咪唑。

给药第7天进行迟发型变态反应耳郭肿胀度检测（DTH）和碳廓清试验，之后对小鼠进行腹腔注射2%致敏红细胞(SRBC)0.2 mL/只。连续注射3 d，之后再过5 d（即给药后第15 d）对小鼠进行眼眶后静脉丛取血和血清溶血素含量的测定。小鼠CO2安乐死，进行腹腔巨噬细胞增殖试验，脾/胸腺指数测定，并且制备细胞悬液完成脾淋巴/胸腺细胞转化试验。

1.3 统计方法

试验数据由IBM SPSS statistics 21软件进行分析，分析方法为单因素方差分析法，方差齐性检验则用LSD法；方差不齐使用Dunnett T3法检测，计量资料均以x±s表示。

2 结果

2.1 matrine对免疫低下小鼠脾/胸腺指数的影响

图1结果显示，同空白对照组相比，环磷酰胺可以提高脾脏指数、降低胸腺指数，结果无统计学意义（P＞0.05）；而 matrine 高、中、低 3 个剂量组均可增加免疫低下小鼠脾/胸腺指数，但是结果无统计学意义（P＞0.05）。

图1 matrine对免疫低下小鼠模型脾/胸腺指数的影响

2.2 matrine对免疫低下小鼠模型细胞免疫的影响

图2A结果显示，与空白对照组相比，环磷酰胺对小鼠的耳肿胀度影响差异无统计学意义。左旋咪唑组可以显著增加免疫低下小鼠的耳肿胀度（P＜0.05）； 高剂量的 matrine 能显著增加免疫低下小鼠的耳肿胀度（P＜0.05），中低剂量组虽有影响，但无统计学意义。图2B、2C结果显示，与空白对照组相比，环磷酰胺能降低小鼠的脾淋巴细胞 （P＜0.05），但matrine高、中、低3个剂量组均对免疫低下模型小鼠的脾转化率影响不明显（P＞0.05）；matrine高、中、低 3 个剂量组均能显著增加免疫低下小鼠的胸腺指数（P＜0.01）。

图2 matrine对免疫低下小鼠模型T细胞介导的免疫反应的影响

2.3 matrine对免疫低下小鼠抗体形成细胞（B淋巴细胞）的影响

图3结果显示，与空白对照组相比，左旋咪唑组能降低HC50，但不显著；matrine和环磷酰胺组均未对免疫低下小鼠的HC50产生影响，与空白对照组相比无统计学差异（P＞0.05）。

图3 matrine对免疫低下小鼠模型体液免疫的影响

2.4 matrine对免疫低下非特异性免疫功能的影响

图4B结果显示，与空白对照组相比，左旋咪唑组能极显著增加免疫低下小鼠的碳廓清能力（P＜0.01），同时matrine中剂量组增加效果显著（P＜0.05），低剂量组增加效果极显著（P＜0.01）；图4A结果显示，左旋咪唑组能极显著增加免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞的增殖能力（P＜0.01），与空白对照组相比，matrine高、中剂量组腹腔巨噬细胞的增殖能力增加效果均显著（P＜0.05）。

图4 matrine对免疫低下小鼠模型非特异性免疫功能的影响

3 讨论

近年来，中药对免疫系统调节功能的研究日益重要。合理地开发利用中药药材资源，提高动物机体免疫力，具有多重经济和社会价值[4-5]。Matrine能显著抑制正常小鼠巨噬细胞的吞噬功能；抑制血清溶菌酶活力、抗体形成细胞的产生和血清溶血素的生成[6]。机体免疫功能表现亢进时，脾脏细胞也相应地增殖[7]。Matrine一方面可以显著降低免疫功能正常的T淋巴细胞功能，另一方面又可以增加免疫抑制组的T淋巴细胞免疫功能。这体现出matrine对免疫系统调节的双向性。尽管有关于matrine对于健康小鼠细胞免疫、体液免疫等方面的免疫调节作用研究，但没有建立免疫低下小鼠模型，并不能反映matrine对免疫功能状态低下小鼠的免疫调节作用。本试验主要从免疫器官、细胞免疫和体液免疫几个方面，探究了matrine对免疫低下小鼠模型的影响，从而明确matrine对免疫功能低下小鼠模型的免疫调节作用。

本研究中环磷酰胺能提高胸腺指数降低脾指数、抑制小鼠脾/胸腺淋巴细胞转化率，降低耳肿胀度，说明成功地建立了免疫低下小鼠模型。通过本研究发现，与空白对照组相比，免疫增强剂左旋咪唑和matrine组均能增加胸腺淋巴细胞的转化率，但二者均不能完全逆转环磷酰胺抑制的胸腺淋巴细胞转化情况。

T淋巴细胞的功能状态在很大程度上能反映出机体的细胞免疫水平[8-9]。左旋咪唑和matrine均能显著增加免疫低下小鼠耳肿胀度，说明matrine能增强细胞免疫功能。鉴于免疫细胞的数量和刺激剂的不同，免疫细胞在调控机体的免疫功能方面具有重要的作用。而matrine作为免疫抑制药物在临床中多用于治疗病毒性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等疾病[10]，有必要探讨不同剂量的matrine对免疫低下小鼠淋巴细胞转化的试验和免疫细胞分泌细胞因子的影响，研究matrine的免疫调控作用。

Matrine和左旋咪唑组均未对环磷酰胺抑制的HC50产生影响，说明matrine未对免疫低下小鼠产生体液免疫调节作用。matrine和左旋咪唑均能显著增加免疫低下小鼠的碳廓清能力，说明matrine可以促进巨噬细胞的吞噬功能，matrine和左旋咪唑可提高机体的非特异性免疫功能。

有文献报道，matrine注射液辅助宫颈癌化疗的增敏效果显著，能有效降低患者CA125及IL-6水平，显著改善机体T细胞免疫功能[11]；协同环孢素显著延长小鼠异体移植皮肤存活时间[12]；降低骨髓移植（即异基因造血干细胞移植）小鼠的血清干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)水平，产生免疫抑制作用。Matrine能上调干扰素-γ和下调白介素水平，还可以抑制支气管哮喘的炎症反应[13]。上述疾病均为自身免疫疾病模型，由此可见matrine改善了上述疾病的进程，参与机体的免疫调节过程。

总之，matrine能增强免疫低下小鼠的细胞免疫功能和非特异性免疫功能，本试验系统地研究了matrine对免疫低下小鼠的免疫调节作用，为临床开发和利用matrine提供免疫药理学研究基础。